ATP1B4在子宫内膜异位症中作用机制的研究

本室前期应用Clinprot技术，研究子宫内膜异位症得到了5个差异蛋白峰，分别为： 4210Da、5264Da、2660Da、5635Da、5904Da；对五个蛋白峰进行重复验证，其中4210Da、5904Da稳定存在。LC-MS/MS测序，4210Da峰所对应的惟一蛋白为ATP1B4。ATP1B4文献报道较少，无商业化抗体。我们制备了噬菌体抗体，对其活性进行了初步探讨。本研究拟：1）制备ATP1B4抗原和高纯度抗体；2）建立大鼠子宫内膜异位症模型，检测该蛋白的表达与正常组是否有差异；构建质粒上调和下调ATP1B4的表达，观察能否抑制或加速疾病发展；检测细胞内外离子浓度变化；外源补充ATP能否缓解子宫内膜异位症的发生及能否作为治疗的靶点；3）检测ATP1B4在子宫内膜异位症患者和正常人血清及局部组织中的作用功能。

子宫内膜异位症(EM)是妇科常见病，早期诊断困难，缺少敏感性和特异性均高的生物标记物。本中心前期应用Clinprot技术，筛选出了5个EM差异蛋白峰，分别为： 4210Da、5264Da、2660Da、5635Da、5904Da；对五个蛋白峰进行重复验证，其中4210Da、5904Da稳定存在。经LC-MS/MS测序，4210Da峰所对应的惟一蛋白为ATP1B4。目前ATP1B4文献报道较少，无商业化抗体。我中心在本课题中，（1）在前期噬菌体抗体的制备及活性的初步探讨的基础上，成功制备了高纯度的人ATP1B4原核表达的抗原以及高效价的鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体，为研究ATP1B4分子本身及是否能够辅助EM的诊断提供了基础；（2）建立了大鼠EM模型，建模成功率可达64%，外源补充ATP初步显示了治疗作用，该成果已获得国家专利授权，ATP作为临床常用的补充能量用的药物，其药物产品、剂型、作用机理以及副作用已经相对成熟，其价格也比较便宜,相对于孕三烯酮来说，患者的经济负担较小，其副作用也小，适宜在临床大规模的推广; （3）检测了ATP1B4在EM患者和正常对照组中的表达，其在EM患者在位内膜和正常对照组子宫内膜中均呈阳性至强阳性表达，主要定位于腺上皮细胞的胞浆中，在间质中局灶表达，但mRNA和蛋白表达水平未显示显著差异；（4）建立的两株EM来源的永生化细胞系均已传代超过70代且无致瘤性，经鉴定，一株为异位内膜腺上皮细胞永生化细胞系，核型以超四倍体核型为主，命名为hEM5B2，另一株为在位内膜间质细胞永生化细胞系，正常二倍体核型，命名为hEM15A，两株细胞既保留了某些子宫内膜细胞形态学、分子生物学性状的特征，又具有EM患者在位内膜特征性的生物学行为，不仅适用于细胞生长、分化、代谢以及甾体激素作用的研究，为揭示EM的发病机制提供重要的理论依据，也可能有助于EM的临床治疗模式的探索，例如对患者甚至易感人群在位内膜进行“源头”治疗干预。