髓核样USCs—USCs外泌体—藻酸盐凝胶/PLGA复合支架体系对椎间盘退变的作用及机制研究

Intervertebral disc degenerative disease(DDD) caused by intervertebral disc degeneration（IVDD）is the main reason for low back and legs pain. On account of its high morbidity、large cost and high rate of relapse, DDD has become one of the most intractable diseases that severely affects human health. Recently, stem cell transplantation which is one of the most effective potential therapis for IVDD has been used to replenish nucleus pulposus cells（NPCs） in the degenerative disc. In previous study，we found that urine stem cells(USCs) has ability of multipotential differentiation and can resist aging，maintain cell viability and reverse degeneration. In this research，we intend to acquire USCs from urine sample and extract its exosome. By using μ-Slide co-culture system and 3D print technology, we attempt to achieve USCs differentiation to NPCs, abtain NPCs-like USCs—USCs exosome—Alginate gel/PLGA composite scaffold. And then, to achieve its transplantation in degenerative intervertebral disc. In this study, for the first time that we introduce NPCs-like USCs-USCs exosome-Alginate gel/PLGA composite scaffold system into the study of IVDD and try to reveal the function and mechanism of this system，providing new research strategy and laying experimental foundation for clinical therapy of IVDD.

椎间盘退变所继发的椎间盘源性腰痛、椎间盘突出症、椎管退行性狭窄症等疾患是腰腿痛的主要病因，其发病率高、治疗花费大、易复发，是严重影响人类健康的一类疾患。近年来，干细胞移植被用于补充更新退变的髓核细胞，是治疗和逆转椎间盘退变的潜在治疗手段。前期研究中我们发现尿源干细胞（USCs）具有多向分化潜能，且USCs外泌体具有抗衰老、维持细胞活性、逆转细胞退变的作用。本研究拟从尿液中获取USCs，并分离提取其外泌体，采用共培养系统实现USCs向髓核细胞的定向分化，同时利用3D打印技术制得载有髓核样USCs及USCs外泌体的藻酸盐凝胶/PLGA复合生物支架，并实现在退变椎间盘中的移植。本研究首次将USCs—USCs外泌体—藻酸盐凝胶/PLGA复合支架体系引入椎间盘退变的研究当中，试图从分子、细胞、整体水平揭示该体系对退变椎间盘的生物学作用及机制，为临床干细胞治疗椎间盘退变提供新的研究思路，奠定实验基础。

尿源性干细胞作为一种安全、高效、来源广泛的干细胞，由于其具备多向分化潜力、取材简单等优势越来越多的被应用于组织工程等实验研究。且USCs外泌体具有抗衰老、维持细胞活性、逆转细胞退变的作用。本研究中，结合运用生物信息学、蛋白质生物化学、细胞生物学、组织工程学等多种实验研究方法与技术，通过对USCs、USCs来源外泌体的提取及有效成分的鉴定、诱导分化能力机制的探索、以及结合组织工程支架对于动物椎间盘退变模型的干预，对该体系对退变椎间盘的生物学作用及机制进行了初步探索。首先，建立USCs和髓核细胞共培养体系，明确了USCs向髓核细胞的诱导分化能力及相互作用。其次，通过对外泌体的提取和鉴定，明确Matrilin-3蛋白是USCs来源外泌体的重要组成部分，并能够通过TGFβ3通路激活smad-3磷酸化，进而促进髓核细胞中ACAN、COL2的表达，达到延缓椎间盘退变的目的。最后，应用 3D 打印技术成功制备了PLGA支架，同时优化实验步骤，构建髓核样 USCs—USCs 外泌体—多肽水凝胶/PLGA复合支架，在体外明确复合支架的生物学特性。制备SD大鼠及新西兰大白兔的椎间盘退变模型，并将复合支架体系移植到动物模型体内，使用蛋白电泳、PCR、影像学分析等实验方法从分子、细胞、整体水平揭示该体系在体内生物学作用及机制，评价其逆转椎间盘退变的效果。基于该项目的实验内容及研究基础，课题组成功申报一项国自然面上项目，同时资助发表核心论文16篇，其中SCI论文12篇，中文核心论文4篇，申请发明专利2项。项目实施阶段培养了博士研究生2名、硕士研究生2名，正在培养硕士研究生4名。