应用Gateway技术构建Survivin、TGFβ3和TIMP-1三克隆系统并转染抑制椎间盘退变

如何延缓椎间盘退变是一个难题，目前尚无突破性进展。椎间盘细胞的过度凋亡、基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制因子失衡、以及椎间盘细胞蛋白多糖和II型胶原合成的减少，是椎间盘退变三个主要环节，共同控制着椎间盘的生理、病理状态。本项目拟应用Gateway技术这种新型、高效的多克隆载体构建技术，将新型的腺相关病毒载体pSNAV2.0创建为目的载体，并进一步构建包含Survivin、TGFβ3和TIMP-1三种目的基因的多克隆表达系统，导入退变的椎间盘细胞内，获得Survivin、TGFβ3和TIMP-1的准确、定向、高效表达，并产生相应的生物学效应，通过抑制椎间盘细胞的凋亡，促进椎间盘细胞外基质的合成，抑制椎间盘细胞外基质的分解，实现对椎间盘退变三个主要环节的干预，从而有效延缓椎间盘组织的退变。

椎间盘退变继发的腰椎间盘突出、椎管狭窄等疾病是腰腿疼痛的主要病因，而如何延缓椎间盘退变，目前尚无突破性进展。本课题针对椎间盘退变机制选定目的基因利用转染技术探究延缓椎间盘退变的作用。研究了survivin基因在椎间盘中的表达及其在对促进细胞增殖及抑制细胞凋亡的作用，明确了survivin在髓核退变机制中起到一定作用，为survivin基因治疗奠定理论基础。进而探究了慢病毒介导survivin单基因体外转染对髓核细胞形态的影响。基于重组质粒构建技术，成功利用“自剪切多肽2A”建立共表达载体，并有效地包装含有不同目的基因的慢病毒，为基因转染提供良好工具。研究发现了TGFβ3和TIMP-1双基因转染髓核细胞有延缓退变的作用，而survivin、TGFβ3及TIMP-1共转染时无延缓作用。同时，进行了survivin、TGFβ3及TIMP-1体内共转染退变髓核的动物实验，证实其积极作用。此外，研究人颈椎后纵韧带交感神经纤维形态及分布，由此推测这些交感神经分布的意义，继而讨论基因治疗的可能性。