Utrophin参与肾小球足细胞骨架相关蛋白分子重塑及蛋白尿发生的机制

Proteinuria is not only the common feature of kidney disease, but also the important risk factor for development of end stage renal disease and cardiovascular events in human. Recently, we identified that utrophin is expressed in podocyte of glomeruli from human and mouse kidney, furthermore, Knock-down of utrohpin induced peri-cardial edema, glomerular abnormality and proteinuria in zebrafish, which indicated that utrophin, as one of the cytoskeleton associated protein in podocytes, may play a key role in maintianing sturctural and functional integrity of podocyte in glomerular filtration barrier. ..For that reason, we try to analyze the change of the expression levels of F-actin, foot process molecules, and cytoskeleton associated proteins after knock-down or over-expression of utrophin in podocytes in present study. Podocye morphology and functions (endocytosis, adhension, migration, et al.) will be evaluated together. Meanwhile, by generating the utrophin/dystrophin double knock-out mouse, we can unearth the effects of utrophin knock-out in mouse with phenotype observations. It will be also possible to determine the up- or down-stream molecules which interact with utrophin in podocytes by co-immunoprecipitation and Mass spectrometry. ..Above all, expecting results in present study will help us for uncovering the role of utrophin in maintaining the structural and functional integrity of podocyte, for further understanding of importance of cytoskeleton molecualr reorganization in podocyte in the pathogenesis of proteinuria and glomerular disease.

蛋白尿不仅是各类肾脏疾病常见的临床表现，更是导致终末期肾病、多种心血管事件的重要危险因素。本小组新近发现，Utrophin在足细胞局部有明显表达，其表达下调可导致斑马鱼出现水肿、蛋白尿及肾小球结构改变，表明Utrophin可能是足细胞骨架相关蛋白，对足细胞保持正常形态及功能具有重要意义。我们计划，应用 RNA干扰及过表达技术改变Utrophin表达后，分析足细胞形态及功能变化，骨架相关蛋白及足突分子的表达变化；建立Utrophin/Dystrophin基因双敲除小鼠，观察应激状态下小鼠的表型变化；同时，分析足细胞局部与Utrophin存在交联的上下游分子，最终阐明Utrophin参与维系肾小球滤过膜功能完整性的分子机制，为临床蛋白尿病人的治疗提供理论及实验依据。

蛋白尿不仅是各种肾小球疾病极为常见的临床表现，也是导致病情进展为终末期肾病及其他众多心血管事件的主要危险因素。蛋白尿的发生机制较为复杂，迄今尚未明确，但近20年来的研究表明，肾小球滤过屏障功能的异常，特别是肾小球上皮细胞（足细胞）生理功能的异常是导致蛋白尿发生、发展的重要因素。.在本研究中，我们首先发现，Utrophin 在人类、小鼠肾小球上皮细胞系膜细胞，特别是足细胞有显著表达；其表达 Knock-down后，模式动物斑马鱼出现 Peri-cardial edema（大体观）、肾小球细胞数量减少和结构异常（显微观）以及蛋白尿（功能改变）等异常变化。在此基础上，我们发现：①采用免疫荧光法及激光共聚焦显微镜技术Utrophin在健康人肾组织及芬兰型先天性肾病综合征患者肾组织，均主要表达在肾小球足细胞，与特异性表达于足细胞的足突分子Synaptopodin的表达有高度重叠。RT-PCR分析Utrophin在各组织的表达情况，发现Utrophin在心脏、纯化的肾小球等组织表达比较明显。②过表达Utrophin后小鼠体外培养足细胞系（MPC5）细胞的细胞骨架蛋白有显著增加，胞内应力纤维（Stress Fiber）的数量较前明显增多，细胞形态也变得更加成熟，伸出的伪足更多。足细胞迁移能力有明显增强。③足细胞Utrophin表达下调后F-actin 表达下调，可见细胞胞膜边缘毛糙，细胞骨架模糊，足细胞增殖能力、黏附能力均有显著下调，且干扰组凋亡率高于对照和阴性对照组。④用通过Cre-loxp系统在Dystrohphin-KO小鼠足细胞特异性敲除Utrophin，分析该小鼠的表型包括小鼠生长、死亡等情况，小鼠外观异常及发育情况，小鼠是否出现蛋白尿、血尿等表型，小鼠肾脏病理超微结构改变（肾小球光学显微镜、免疫荧光及电镜超微结构等改变等）。结果发现，部分足细胞Utrophin特异性KO小鼠存在轻度肾小球滤过膜结构异常及少量蛋白尿，但体重、外观、血液生化等指标没有明显异常。.本研究结果表明，Utrophin是人类、小鼠、斑马鱼等生物肾小球足细胞的重要分子，其正常表达对维系肾小球足细胞细胞骨架及迁移、黏附、生存等生理功能具有重要意义，其在肾小球局部的表达异常可能导致斑马鱼、小鼠乃至人类出现肾小球滤过膜完整性破坏、蛋白尿以及肾小球病理改变。