果实成熟特异转录因子MADS1的功能研究

果实成熟受许多因子调控，在研究番茄果实成熟过程中，我们克隆到一个果实成熟特异表达的MADS盒基因MADS1，而且在番茄成熟突变体rin 和Nr中表达较弱。本研究拟利用已克隆的番茄MADS1基因，构建该基因的超表达载体，转化番茄rin和Nr突变体，筛选MADS1基因超表达的转基因番茄突变体株系，根据番茄突变体果实能否恢复成熟状态，分析番茄MADS1基因的功能；并构建该基因的RNAi沉默载体，转化普通番茄，获得MADS1目标基因沉默的番茄株系，研究MADS1基因对番茄果实成熟、抗病性和耐贮性的影响。利用合成的随机20碱基二聚体 DNA片段与凝胶移位结合分析技术，研究 MADS1 蛋白的DNA特异结合域，并通过酵母双杂交技术，研究MADS1蛋白与其它MADS蛋白的相互作用。进一步明确MADS1蛋白调控果实成熟的作用机理。

本研究克隆得到一个与果实成熟特异因子SlMADS-rin高度同源的MADS-box基因SlMADS1，采用定量RT-PCR技术，研究了MADS1基因在番茄不同器官及不同发育时期的表达特性。结果表明，该基因在野生番茄AC++的营养器官，如根中几乎不表达，而在繁殖器官，如花及果实中表达量很高，并且随着果实的成熟表达量逐渐降低，在突变体Nr及rin的果实中表达量亦随其成熟度逐渐降低，由此可见，该基因可能与果实成熟调控密切相关。为进一步揭示该基因的生理功能，构建了MADS1目标基因超表达和沉默载体并培育了多个转基因番茄株系，研究发现MADS1沉默株系表现出果实成熟提前的现象，而超表达转基因番茄果实及其他未见明显表型；通过类胡萝卜素的提取鉴定发现MADS1沉默果实的类胡萝卜素积累明显高于发育同时期的野生型果实；乙烯释放量检测表明，沉默转基因株系番茄的乙烯释放量较野生型高2-4倍，而超表达转基因番茄的乙烯释放量比野生型低2倍左右。 三重反应实验结果表明在没有添加ACC的情况下MADS1沉默株系幼苗表现出下胚轴变短的现象，并且沉默株系幼苗对ACC的敏感度明显高于野生型幼苗，并且沉默幼苗中参与乙烯合成的基因表达量都大量上调；而MADS1在ACC处理野生型幼苗过程中随着ACC浓度的升高表达量逐渐降低，由此进一步证明了MADS1调控了乙烯的合成过程。利用酵母双杂交技术分析了MADS1与其他MADS-box家族蛋白的相互作用，发现MADS1与MADS-RIN之间存在相互作用。通过以上研究表明MADS1基因编码了一个果实成熟的负调控因子，这是目前发现的第一个作为负调节因子调控番茄果实成熟的MADS-box家族转录因子。因此，该研究成果对果实成熟调控网络的完善做出了重要贡献。