移植静脉重塑中PCNA及其配体蛋白的蛋白组学研究

It remained unclear about the mechanism of vascular remodeling in vein grafts restenosis. Based on our early research, this project selects Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) and its ligadins as the entry point. We apply the Co-Immunoprecipitation (Co-IP) and two-dimensional electrophoresis with mass spectrometry technology to analyze the differences of these ligadins. Combining with the morphology, immunohistochemistry, Western-Blot, TUNEL method to detect the cell proliferation and apoptosis of vein grafts, we try to find the key proteins and their regulation time in the remodeling regulation process. So our research will supply the new methods for the future study in researching the signal transduction pathways in vein grafts remodeling and finding the effective intervention targets and intervention time.

静脉重塑在移植静脉再狭窄中作用机制尚未明确，本课题在我们前期研究基础上选择增殖细胞核抗原（PCNA）及其配体蛋白作为研究切入点，通过免疫沉淀结合二维蛋白电泳质谱分析技术对这些配体蛋白进行差异性分析，同时结合形态学、免疫组化、western-blot、TUNEL法检测移植静脉细胞增殖及凋亡情况，探索重塑调控过程中关键蛋白及其调控时机。本研究为今后进一步研究移植静脉重塑的信号传导通路，探索有效的干预靶点和干预时机提供新的思路。

冠脉搭桥术后移植静脉桥易发生再狭窄，在很大程度上影响病人的远期疗效。研究的内容主要包括以下三方面：（1）兔移植静脉重塑中凋亡及增殖的时间特性：通过建立兔颈外静脉至同侧颈总动脉的动物模型， HE染色发现，内膜厚度术后1d组较正常静脉组(1.52±0.3µm vs 4.58±0.8µm)比较显著下降(p<0.05)，自术后3d(4.57±0.7)µm组以后各组呈持续性升高趋势。TUNEL法检测细胞凋亡显示，术后1d细胞凋亡达高峰期，较对照组而言凋亡水平显著上升(18.61%±1.5% vs 1.36%±0.2% , p<0.05)然后缓慢下降，至术后7d(1.98%±0.4% vs 1.36%±0.2% , p<0.05)凋亡呈低水平。Western-blotting中显示术后1d PCNA条带灰度百分比低于正常对照组，术后7d PCNA条带灰度百分比达峰值，显著高于正常对照组，之后平缓下降。（2）移植静脉桥关键时间点转录组学研究：选择术后1d，术后7d的移植静脉与正常静脉进行兔4x44K 基因表达谱芯片检测显示，术后第1d、第7d，上调表达差异基因的显著性GO分别为1259、1344个；下调表达差异基因的显著性GO分别为1235、1158个。（3）14-3-3蛋白在移植静脉桥中的表达研究：选择移植术后第1d和第7d移植静脉和对照组的正常静脉，通过PCNA抗体免疫沉淀，用质谱Label-free定量分析技术对PCNA这些配体蛋白进行差异性分析，发现术后1d与术后7d差异蛋白数目分别为30和37个。术后第1d和第7d差异表达蛋白质GO及其富集分析显示GO在BP分类中富集的前15个注释中，氮代谢合成，细胞刺激反应富集度较高。KEGG通路注释中显示PI3K-Akt信号通路、Focal adhesion通路较富集，14-3-3γ蛋白与其密切相关。蛋白质聚类分析中显示目标蛋白质YWHAG和ITGA在同一子集中。我们发现14-3-3γ是移植重塑过程中PCNA的配体蛋白，且其在移植后表达增加，尤其是急性损伤期更明显，为进一步深入研究提供方向与理论基础。