丙酮丁醇梭菌丁醇毒性的分子机理研究

丁醇对动物细胞产生毒性的分子机理已经阐明，而对微生物细胞的分子毒性机理尚未见报道。本研究通过对动物细胞蛋白激酶C与丁醇作用的结构和序列的保守性分析，在产丁醇微生物Clostridium acetobutylicum蛋白质组中寻找与蛋白激酶C丁醇结合区结构和序列相似蛋白即靶蛋白，通过靶基因的插入失活和过量表达，利用蛋白质组学技术、real-time PCR和生理学分析检测突变体和靶基因响应丁醇浓度时蛋白质组、RNA水平的差异表达以及生理学变化，推测靶蛋白调控丁醇毒性的分子机制；此外，体外表达靶基因，检测靶蛋白与丁醇的结合特性，分析靶蛋白与丁醇作用的分子机制；研究结果将初步阐明靶基因介导丁醇毒性的分子机制，为C. acetobutylicum 菌种改造以及新型工艺的开发提供理论基础，同时为其它醇类生产菌株的改造提供理论指导和借鉴。

醇类是一类重要的平台化学品，其对微生物产生的毒性是限制醇类大规模工业化发酵生产的重要因素。实现醇类的经济高效生产需要我们针对产醇微生物开发一套高效的遗传操作系统，深入阐明醇类的毒性机制，从而能够实现对产醇微生物进行理性设计。丁醇是一种重要的燃料添加剂和汽油替代品。本论文以产丁醇微生物Clostridium. acetobutylicum DSM 1731作为研究材料，设计了一个将逆转录转座与同源重组结合起来的基因删除策略。这一策略的第一步是在II型内含子的下游引入与拟删除基因上游同源的一段序列（简称为同源序列）；第二步是通过逆转录转座作用，将携带有同源序列的II型内含子插入梭菌基因组；第三步是筛选单交换同源重组的基因型，获得目标基因、操纵元或基因簇得以删除的突变株。采用这一新策略，我们对位于C. acetobutylicum染色体及大质粒上的两个操纵元CAC1493-1494(SMB_G1518-1519)和ctfAB分别进行了有效删除。理论上，只要能够应用II型内含子插入失活系统的梭菌（甚至其它细菌），都可以采用这一策略来实现基因删除。另外，我们利用蛋白激酶C与丁醇作用机制的保守性，通过一种简化的生物信息学方法在C. acetobutylicum蛋白质组中筛选到一个与蛋白激酶C丁醇结合区具有30%相似性的未知功能基因CAC1493(SMBG1518)，其编码蛋白有可能介导了C. acetobutylicum丁醇毒性。通过在生理学、蛋白质组学和细胞学水平上的分析，我们认为调控细胞的完整性和运动性是CAC1493-1494(SMB_G1518-1519)介导C. acetobutylicum胞内丁醇毒性的两个重要机制。CAC1493-1494的功能鉴定表明细胞膜模型并不能完善的解释细胞丁醇毒性机理，本研究为新模型的提出提供了几个有力证据。