丙酮丁醇梭菌纤维介质固定化提高丁醇耐性的分子机制

Butanol tolerance of Clostridium acetobutylicum is the key of butanol fermentation，which influences final butanol titer in fermentation broth and energy consumption for butanol recovery. In our previous work, cell immobilization of C.acetobutylicum by fiber significantly improved butanol tolerance, specific glucose uptake rate and butanol production rate,leading to various differentially expression of proteins that are involved in heat shock response, flagellar movement and sporulation etc,but the mechanisms underlying these phenomena are not clear. We propose that cell immobilization not only enhance cell density,but also creat a unique micro-environment for more effective quorum sensing of cells through the accumulation,transduction and sensing of signal molecules such as oligopeptide and ester derivatives,which consequently results in the improvement of butanol tolerance and butanol production. In this project,the mechanism of the enhanced butanol tolerance and quorum sensing of C.acetobutylicum induced by fibrous immobilization will be investigated to validate the scientific hypothesis by detecting the signal molecules. Furthermore,process engineering for regulation of the quorum sensing will be conducted with the aim to improving butanol tolerance and the performance of butanol fermentation.At the end,the achievement could elucidate the mechanism underlying the enhanced stress tolerance of fibrous immobilized cells and give new guidance for the process engineering of butanol fermentation and strain development.

丙酮丁醇梭菌的丁醇耐性差是发酵终点产物浓度极低，导致产品分离能耗高的主要原因。前期研究发现，纤维介质固定化显著提高梭菌细胞的丁醇耐性、比糖吸收速率和比丁醇生成速率，并且使相关蛋白差异表达，但其机理尚不明确。我们推测，纤维介质固定化不仅使细胞密度显著提高，而且其特殊的微环境有利于信号物质(如寡肽、酯类衍生物)累积、传导和感知，诱导细胞产生群体效应，进而提高细胞的丁醇耐性，强化丁醇发酵过程。为证明这一假说，本项目将从基因表达和代谢分析入手，研究相关基因（热休克基因、agr群体效应基因、膜合成基因和鞭毛基因等）的表达差异，考察群体效应产生和丁醇耐性增强的变化规律，及其与基因表达的内在联系，分析鉴定信号物质，解析细胞胁迫耐性增强的分子机制，并通过过程工程手段进行调控，提高菌体的胁迫耐性和丁醇发酵水平。预期结果不仅可以丰富微生物群体行为的认知，而且为丁醇发酵过程调控和菌株改造提供新思路。

丁醇被认为是比乙醇更有价值的先进生物燃料，能量密度比乙醇高30%，与现有成品油输送和贮藏设施兼容性好等优点。利用发酵法生产丁醇面临的主要问题是丁醇对丙丁梭菌细胞有毒性抑制作用，导致发酵终点丁醇浓度和生产强度低，产品分离能耗高。纤维固定化细胞培养可以使丙丁梭菌细胞紧密接触，提高细胞在反应器中的密度。我们发现纤维固定化体系中的梭菌细胞的存活率更强，说明纤维介质固定化可以增强梭菌细胞的丁醇耐性。和游离细胞体系相比，纤维固定化体系的梭菌细胞，在发酵的对数期和静止期，比糖吸收速率分别提高了14.6 %和60.4 %，比丁醇生成速率分别提高了，说明单位细胞的生产活力更强。固定化体系的发酵时间缩短了26.4 %，发酵终点的丁醇浓度提高35.0 %，说明梭菌的整体发酵性能显著提高。细胞密度的增加是信号物质积累、传导、感知和细胞产生群体效应的重要基础。因此，通过基因背景分析，发现丙丁梭菌中可能存在有硫代内酯作为信号分子的agrBDCA群体效应系统。利用内含子失活技术和基因回补实验构建了agrB（cac0078）， agrC（cac0080），agrA（cac0081）基因工程菌，通过由agrD编码的硫代内酯环肽添加实验确认了丙丁梭菌中存在agr群体效应系统，并初步证实该系统对梭菌孢子形成，胁迫耐性，细胞生长和产溶剂以及相关基因表达有密切影响，还需在高密度培养体系深度挖掘该群体效应系统的功能。建立了在线丁醇移除与解除细胞抑制的发酵分离耦合技术，利用发酵自产的尾气（二氧化碳和氢气）与丁醇分子间的吸附作用，实现在线移除发酵抑制性产物丁醇和反应器内丁醇浓度的自由调控，使反应器内的细胞密度增加或延缓发酵后期细胞自溶，强化细胞群体效应产生，使丁醇的生产强度提高了40%以上，分离得到的丁醇浓度比文献报道提高3-6倍。以上研究成果共发表SCI论文12篇（第一作者9篇，ESI高被引1篇，JCR一区6篇），授权中国发明专利7项（第一发明人），PCT国际申请1项，这些研究成果为提高高密度发酵的丁醇转化效率和优良菌株构建提供了理论基础和技术支撑。