锌离子对丙酮丁醇梭菌发酵的调控机制

The effect of zinc supplementation on batch butanol fermentation by Clostridium acetobutylicum was studied using glucose as substrate. It was found that fermentation time was shortened significantly due to the enhancement of glucose uptake, cell growth, and acid reassimilation associated with the zinc supplementation, and correspondingly both butanol productivity and yiled were improved. In this project, the transcriptional analysis will be performed at global levels to screen genes whose expressions are affected sigificantly by the zinc supplementation and regulators responsible for the shift of the intracellular metabolism. Metabolic network will be established for the formation and reassimilation of acidic intermediates and solvent production to further detect key enzymes regulated by the zinc supplementation. With this progress, molecular mechanism underlying this phenomenon is expected to be eluciated, and in the meantime strategies for strain modifications through metabolic engineering can be developed for more efficient production of butanol, an advanced biofuel.

在利用丙酮丁醇梭菌进行批次发酵过程中，发现培养基中添加锌离子能够显著缩短发酵时间，促进葡萄糖的利用及细胞生长，并强化有机酸重吸收，提高丁醇产量及丁醇产率。针对这一实验现象，本项目拟在全局水平考察锌离子添加对丙酮丁醇梭菌发酵过程基因表达的影响，在此基础上鉴定并筛选关键调控基因及调节蛋白，系统阐释锌离子作用于丙酮丁醇梭菌的多效调控分子机制，建立代谢网络模型，对有机酸和溶剂代谢途径中关键节点的代谢流分布进行分析，寻找代谢过程改造或调控靶点，在分子水平对丙酮丁醇梭菌进行定向改造，最终获得具有优良发酵特性的优势菌株。预期取得的研究进展，不仅有助于加深对锌离子调节丙酮丁醇梭菌生理和代谢过程机理的认知，而且对构建丁醇高产菌株、提高发酵效率、降低丁醇生产成本，具有重要意义。

锌（Zn2+）作为微生物细胞生命代谢必需微量营养元素及关键辅因子受到广泛关注，揭示其在生物丁醇生产中对丙酮丁醇梭菌生理代谢的调控作用及机制对挖掘功能基因及建立菌株改造策略等具有重要的理论研究意义。本项目通过生物过程工程策略、胞内代谢水平分析、转录组学分析及基因工程改造策略等，系统阐释锌离子对丙酮丁醇梭菌丁醇发酵的多效调控作用及机制。通过对胞内关键代谢物进行LC-ESI/MS定量分析，发现锌调控机制在代谢水平具有全局调控特性。锌响应状态下，中心碳代谢催化转化加快，发酵前期胞内糖酵解代谢产物G6P、F6P、FBP与PEP以及产酸/产溶剂代谢节点产物AcCoA、AcAcCoA与BuCoA含量降低，能量代谢产物ATP及还原力NADH水平提升，促使乙醇/丁醇代谢通路提前开启以维持胞内氧化还原平衡，进而引发胞内碳流在关键代谢节点处重分配。全局转录组学分析表明，在锌离子响应状态下，多种碳源（二糖、己糖及戊糖)转运与代谢关键基因如葡萄糖转运基因glcG、CAC1353与CAC1354、果糖操纵子fru以及木糖/阿拉伯糖转运与代谢等相关14个基因转录水平显著上调，糖酵解及产酸/产溶剂代谢相关13个基因转录水平也不同程度上调，但产氢代谢关键基因hydA、转录调控基因abrB，ctsR与hrcA以及胁迫应答基因转录水平下调。基于葡萄糖转运调控策略，在丙酮丁醇梭菌中分别过表达glcG、CAC1353及CAC1354，在基因水平验证锌离子调控机制。过表达CAC1353或CAC1354重组菌株生长代谢出现迟滞；过表达glcG重组菌株ABE发酵性能显著提高，发酵周期缩短并稳定在28 h，丁醇产量及产率最高可达13.9 g/L及0.50 g/L/h，且甲酸、乙酸、丁酸及丁醇胁迫耐受性增强。胞内代谢分析表明过表达glcG在代谢水平也具有全局调控特性，引发胞内中心碳流通量与辅因子含量水平的级联调控，影响能量代谢及氧化还原水平，证实glcG是丙酮丁醇梭菌锌离子调控机制的有效调控基因位点。利用过表达glcG重组菌株以预处理玉米秸秆酶解液为碳源的ABE发酵，丁醇产率由0.18g/L/h提高至0.44 g/L/h，该调控策略有助于提高木质纤维素类生物质发酵生产丁醇的竞争力。