脂肪酸合成酶的组装和底物识别机理研究及特定链长脂肪酸的可控生物合成

Fatty acid biosynthesis is a classical model for C-C bond formation and carbon chain elongation, which is also a basis for the synthesis of many sophisticated natural products. The elongation cycle of fatty acid synthase include 4 steps, catalyzed by the following enzymes: 3-ketoacyl ACP synthase, 3-ketoacyl ACP reductase, 3-hydroacyl ACP dehydratase and 2-enoyl ACP reductase, respectively, determining the chain length of fatty acyl tails of the end products. Our application mainly concerns two of the steps: 3-ketoacyl ACP reduction, and 2-enoyl ACP reduction. We wish to understand the enzyme assembly and substrate recognition mechanism of these two reactions, aiming pave a way for the controllable synthesis of fatty acids with specific chain length. We are on the way to manipulate the substrate recognition properties of the two enzymes and thus to generate synthetic pathways which do not exist in nature. We expect our system will be a useful tool for biofuel and various chemical productions.

脂肪酸生物合成是碳碳双键形成和碳链延伸的经典范例，也是许多复杂天然产物合成的基础。在脂肪酸生物合成系统中，3-酮基脂酰合成酶、3-酮基脂酰还原酶、3-羟基脂酰脱水酶、2-烯脂酰还原酶催化四步化学反应，形成脂肪链延伸的循环，决定着产物脂肪酸的链长。本申请主要涉及其中的第二和第四步反应，即3-酮基脂酰还原和2-烯脂酰还原。研究和理解参与这两步反应的酶的组装和底物识别特性，很大程度上为控制脂肪酸的链长铺平了道路。我们将根据酶与底物识别特点，改造自然界的脂肪酸生物合成通路，制备所需要的特定链长的脂肪酸，用于生物燃料等新能源或其他复杂分子的研究和生产。

线粒体脂肪酸合成 (mtFAS)在真核生物（含哺乳动物）细胞中是呼吸作用和生者所必须的关键通路。人类的3-ketoacyl-acyl carrier protein (ACP) reductase (HsKAR)蛋白是负责催化这个通路第二个反应的唯一的酶。它是由两个不同蛋白即17β-hydroxysteroid dehydrogenase type-8 (HSD17B8, α亚基) 和 carbonyl reductase type-4 (CBR4, β亚基)组装成的异构四聚体（α2β2）。我们通过蛋白晶体研究了KAR的空间结构（含NAD(+) 和NADP(+)辅酶）。对可能参与底物识别和催化的位点，我们进行了突变，并通过酵母功能互补技术和酶的动力学进行分析。数据显示NADP（H）结合位点和ACP底物结合催化位点在CBR4亚基，而HSD17B8亚基有助于形成功能完整的KAR。HSD17B8内部有NAD(H)结合位点，能催化CoA底物（3R-hydroxyacyl-CoA）。这些CoA底物也许来自于不饱和脂肪酸的降解，通过KAR进入线粒体β-氧化通路。细胞中的蛋白是高度动态的，蛋白之间的组装和功能也是瞬时可变的。这类改变经常由蛋白-小分子和蛋白-蛋白之间的超分子相互作用启动。KAR对这类研究提供了理想模型和样板。.对mtFAS的另外一个酶MECR进行了工程改造，希望获得理想的底物口袋突变体。我们做了一系列针对底物口袋的突变体，并通过过量表达的大肠杆菌细胞提取物分析了它们底物链长偏好的改变。数据显示我们没能获得理想的MECR突变蛋白。由于这个原因，最终只能放弃后面生物工程改造细菌的计划。 .在研究KAR酶的组装和功能的过程中，我们发现了一个过去大家不太注意的侧面，即蛋白相互作用、聚集过程中，结构会发生一些明显的变化，这些变化极大地影响蛋白的性能。例如KAR的两个组分中，CBR4负责催化功能，可是它在遇到HSD8之前，这个催化功能是没有的。我们把这一类现象称作蛋白异构化，也就是说蛋白组成与序列不变的情况下，结构、功能的变化及相互之间的联系。据此我们较大幅度地调整了研究计划，开设了一个新的研究方向：蛋白异构化的监测和生物应用。其中监测是指设计新的探针，用于识别蛋白异构化（结构变化）；生物应用是指运用探针与一些特异蛋白结构的识别关系从而形成一类新型的生物-非生物杂化材料。