鱼类脂肪酸去饱和酶的底物识别与偏好性机制研究

Highly unsaturated fatty acids (HUFA) are healthy benefit to human and most animals. Fish are mainly source of n-3 HUFAs, but owing to complex key enzymes, especially fatty acid desaturase, there are huge differences HUFA biosynthesis abilities in different speciec fish. Two remarkable characteristics of fatty acid desaturases in HUFA biosynthesis are functional diversity and n-3 substrate preference in fish, which mechanism should be studied. In this project, we focus regioselectivity and substrate preference of several desaturases from fish and mammalian, such asΔ6/Δ5 and Δ4 desaturases of rabbitfish, Δ6/Δ5 desaturase of zebrafish, Δ6 desaturase of cobia, and Δ6 desaturase of mouse which has n-6 substrate preference. First, study the relationship of primary structure and molecular functional characteristics specific regioselectivity and n-3 substrate preference of desaturase in fish by performing directional transformation with quantitative heterogeous functional characterization in Saccharomyces cerevisiae. Then, explain the molecular basis of regioselectivity and substrate perference of desaturases by summarizing conservative region or concensus sequence, predict a structure model to explain mechanism of regioselectivity and n-3 substrate preference of fish desaturases. This project is the first time focus molecular character of desaturase. The prespective achievements would enrich research contents of fish molecular nutriology, set up bases for studying relationship of structure and function of member-bound fatty acid desaturase, understand pathway and mechenism of HUFA biosynthesis in fish, and reveal n-3 HUFA enrichment mechanism in fish, as well as provide the theoretical foundation to get new gene, develop new theroy, and perform transformation in expectation.

高度不饱和脂肪酸（HUFA）对人和动物体的健康具有重要功能。鱼类是HUFA的重要来源，但不同鱼类的HUFA合成能力不同，主要与HUFA合成关键酶- - 特别是脂肪酸去饱和酶（FAD）的种类和活性的差异有关。鱼类FAD具功能多样性和n-3底物偏好性的特点，但目前尚缺乏相关机制的研究。本项目拟选择几种典型的FAD（黄斑蓝子鱼Δ6/Δ5及Δ4、斑马鱼Δ6/Δ5、军曹鱼Δ6以及偏好n-6底物的小鼠Δ6去饱和酶）为研究对象，通过对不同FAD一级结构的序列比对、拓扑结构预测、基因定向改造和酶活性鉴定等方面的系统比较、分析，以阐明酶的结构与功能的关系，并揭示鱼类FAD的底物识别及n-3底物偏好性的分子基础和机制。本项目首次聚焦FAD的功能特性，项目成果不仅对于丰富鱼类分子营养学内容具有重要的理论意义，也有助于揭示鱼类富集n-3 HUFA的分子机理，还可为鱼类FAD基因资源的发掘和应用等提供理论依据。

脂肪酸去饱和酶（Fads）是动物合成长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）的关键酶。哺乳动物的Fads1具有Δ5去饱和活性，Fads2具有Δ6去饱和活性。而硬骨鱼仅含有Fads2，多数海水鱼类因缺乏Δ5去饱和活性而不能和LC-PUFA。然而，鱼类的Fads2显示功能多样性，如Δ6/Δ5双功能Fads弥补了Fads1的缺失，某些鱼类的Fads2还具有完全的Δ5甚至Δ4活性。因此，阐明鱼类Fads功能特性的分子结构基础，对于弄清鱼类Fads分子进化机制、解释海水鱼类为何LC-PUFA合成能力低下具有重要的理论意义。. 本项目发现草鱼、黄斑蓝子鱼、大西洋鲑和日本鳗鲡等硬骨鱼的Fads2都具有n-3脂肪酸底物偏好性，结合其他文献报道，表明所有鱼类都对n-3底物有更高的催化活性。选择以蓝子鱼Δ6/Δ5 Fad和Δ4 Fad为研究对象，通过对应片段的置换及点突变，发现Δ6/Δ5 Fad的苯丙氨酸F（278，氨基酸残基位置，下同）、组氨酸H（279）、谷氨酸Q（281）和缬氨酸V（296）以及Δ4 Fad中对应的酪氨酸Y(280)、天冬氨酸N（281和283）和丝氨酸S（298）对Fad的底物识别起决定作用，上述氨基酸的置换将导致Fad功能的颠换。对关键氨基酸进行分析，发现来自Δ6/Δ5 Fad的氨基酸的R基团相比其对位氨基酸更为“丰满”，如果形成一个催化“口袋”，Δ6/Δ5 Fad的“口袋”更小一些，无法装下Δ4 Fad的底物。逐个置换关键氨基酸，Fad底物的专一性也将从18C向22C过渡。而所有n-3系列脂肪酸底物都比其对应的n-6底物略小，更容易进入口袋，因此，所有Fad都对n-3底物具有偏好性。 为了确定Fad蛋白的跨膜拓扑结构，通过在特定位点插入双荧光标记，确定了N端在内质网内侧、C端在细胞质侧的跨膜结构模型。与底物识别有关的关键氨基酸分别位于两个相邻的疏水结构域末端，可能起稳定局部构象的作用。. 本研究初步揭示了Fad结构与功能的关系，首次提出了Fad底物识别及偏好性的分子模型，并通过实验确定了其跨膜拓扑结构。研究结果对揭示鱼类Fad的分子进化规律具有重要的理论意义，对进一步挖掘LC-PUFA合成相关的基因资源，通过基因工程的手段获得LC-PUFA有一定应用价值。