高粱茎秆蜡层缺失突变体sb1基因克隆及功能研究

Sorghum wax not only plays a vital important role in sorghum resistance, but also is widely used in food, medicine and chemical production. Up to now, the wax synthesis gene of sorghum has not been cloned. The stem wax-layer deficient mutant sb1 (sorghum bloomless 1) was controlled by a single recessive nuclear gene which was isolated by screening the BTx623 mutant library in our lab. Our study want to detect the waxy crystal structure, the epidermis ultrastructure, the wax composition and content of sb1 mutant by using scanning electron microscopy, transmission electron microscopy and gas chromatography–mass spectrometry technologies. To detect the rates of chlorophyll leaching and water loss in the excised leaves of the stem wax-layer deficient mutant. Super-BSA mixed pool sequencing method is applied to map and clone sb1 mutant gene using the BC1F2 mapping population which have been built earlier. Genetic transformation will be used to verify the gene function. And according to the gene expression profile analysis, we will clarify the role of SB1 and the molecular mechanism of wax synthesis. Cloning and identification wax synthesis genes of sorghum are very important for revealing the molecular mechanism of sorghum wax formation, the role of sorghum wax for drought resistance and in-depth development of sorghum wax.

高粱蜡不仅对高粱抗逆具有重要作用，而且在食品、医药和化工生产中应用广泛。迄今为止，关于高粱蜡质合成相关基因的克隆还未见报道。本实验室在高粱BTx623突变体库筛选过程中，发现了一个茎秆蜡层缺失突变体sb1 (sorghum bloomless 1)，该突变表型由隐性单基因控制。本研究拟利用扫描电镜、透射电镜和气相-质谱联用技术检测sb1突变体蜡质晶体结构、表皮超微结构和蜡质组分含量的变化；分析高粱蜡层缺失后离体叶片失水速率和叶绿素浸出率的变化；利用已构建好的BC1F2突变体基因定位群体，采用Super-BSA混池测序法定位和克隆突变基因sb1，转化基因验证功能，并结合基因表达谱分析，阐明SB1基因在高粱蜡质合成代谢中的作用及蜡质形成的分子机制。深入挖掘高粱蜡质相关基因，对探究高粱蜡形成的分子机制、蜡对抗旱性的影响及深入开发高粱蜡资源都具有非常重要的意义。

高粱蜡质合成、运输、分泌和转录调控途径还不是很清楚，而且高粱蜡质相关基因的研究报道也比较少。因此，深入挖掘高粱蜡质相关基因，对探究高粱蜡形成的分子机制、抗旱性及深入开发高粱蜡资源应用都具有非常重要的意义。. 高粱sb1（sorghum bloomless 1）突变体在整个生育期茎秆和叶片都无明显蜡层覆盖。本研究对野生型BTx623和蜡层缺失突变体sb1农艺性状，离体叶片失水速率，sb1遗传特性，基因定位、克隆以及基因功能等方面进行了研究。研究结果如下：. 1. 经过连续两年农艺性状的统计分析发现，突变体sb1与野生型BTx623相比株高明显降低，但是该突变体蜡层的缺失并没有严重影响植株其他各项农艺性状指标。在抽穗开花期，对野生型BTx623和突变体sb1离体叶片失水速率进行了测定，结果表明突变体sb1失水速率比野生型BTx623快，进一步说明蜡质对叶片保水起到了重要作用。. 2. 突变体sb1分别与BTx623和Rio杂交，通过分析比较F2后代表型的分离比，表明该突变体是受单个隐性核基因控制。. 3. 利用Super-BSA混池测序的方法以及SNP-index关联分析方法，将sb1突变基因粗定位在10号染色体1,502,260-2,308,026范围内约0.81Mb，共含有148个基因。在粗定位区间的左右两侧以及区间内共查找和开发了7对多态性很好的SSR标记（SB5164、sam51358、10-5、SB5180、SB5182、sam01243和sam27102a）和1对InDel标记（10d4A3）。利用已经筛选好的多态标记将sb1突变基因精细定位到两个SSR标记10-5（1.66Mb）和SB5180（1.80Mb）之间约140Kb范围内，共有15个基因。经过PCR测序验证，发现只有一个基因Sobic.010G022000在CDS区发生了单碱基突变，导致一个氨基酸的改变，推测SB1基因是一个α/β水解酶，负责蜡质的生物合成。. 4. 为了验证SB1基因功能，构建了组织特异性表达载体、过表达载体和干扰载体转化水稻和玉米，目前正在进行转化工作。.