高粱缺钾突变体kd1基因的克隆及功能分析

Potassium is an essential element in plant growth and development, gene regulation mechanism of crop uptake ,transportation and use of potassium elements has been reported much, but still need mining genes and QTL which could be applied in nutrient efficient varieties breeding.The library of an M2 generation of ethyl methane sulfonate (EMS)-mutagenized sorghum bicolor seeds (BTX623) was screened for mutants defective in potassium utilization mutant. One mutant that showed potassium deficient symptoms and K+ content in the mutant flag leaf was reduced by 20% compared with flag leaf in wild type.our study showed that the phenotype of mutant was controlled by a single recessive gene. An BC1F2 population was used to clone gene for the mutated traits using a DNA mixed pools sequencing strategy of using 86 mutant phenotype and 86 wild phenotype plants .The mutated gene was mapped on the of chromosome 6 between the 900KB interval area. For further cloning and validation function of the gene, our project will gain candidate gene and confirm its function throught building BC2F2 population in 2013 ,and fine mapping based cloning in 2014. Quantitative RT-PCR analysis of gene expression in sorghum bicolor different developmental stages of different organizations between normal or potassium starvation condition. Construction gene fusion GFP (green fluorescent protein) vector ,then analysis the protein Subcellular localization by onion epidermal transiention expression. The gene over-expression plant lines will be used to gain detail of gene expression pattern and function , to reveal the role of this gene in K+ uptake and utilization pathway and to provide new gene for potassium efficient varieties breeding.

钾是植物生长发育所必需的重要元素之一，作物对钾吸收、转运和高效利用的基因调控研究已有一些相关报道，但仍需挖掘能在生产上有应用且遗传效应大的基因和QTL。本实验室在大田中筛选到表现缺钾症状高粱EMS诱变缺钾突变体，突变体旗叶钾含量下降约20%，研究证实突变表型为隐性单基因控制。构建BC1F2定位群体，利用BC1F2中突变体表型及野生表型植株各86株进行DNA混池法测序，将基因粗定位于第6条染色体900KB区间内。为进一步克隆和验证基因功能，本项目拟2013年继续构建BC2F2定位群体，2014年进行精细定位，获得候选基因及其功能互补验证。取高粱不同发育时期不同组织及钾饥饿条件下不同组织进行定量PCR分析基因表达、构建基因融合GFP（绿色荧光蛋白）载体进行洋葱表皮瞬时表达及利用基因超表达转基因植株，研究基因的表达模式和功能，揭示该基因在K+吸收利用中的作用，为钾养分高效品种培育提供新基因。

高粱是重要的五大作物之一，而磷是植物重要的营养元素。在拟南芥、水稻中，植物响应低磷信号途径都有较深入的研究，但在高粱中所知甚少。本研究通过EMS（甲基磺酸乙酯）人工诱导高粱突变体，筛选到一株BTX623缺钾症状突变体，通过与野生型BTX623回交分析表明，该表型是受一个隐性单基因调控。与RIO野生型杂交，构建定位群体，进行图位克隆，最终将此基因定位到第9条染色体上，通过定位区间基因分析，最后克隆了该基因Sb09g028110。Sb09g028110是拟南芥、水稻中PHO2基因的同源基因，PHO2在植物低磷响应信号途径中起重要作用。经互补实验，在水稻ospho2突变体超表达高粱野生型SbPHO2，高粱中SbPHO2能部分互补OsPHO2功能，35S-SbPHO2/ospho2水稻株系叶尖坏死减少，也缓解该植株生长受抑制的表型，且有效磷含量较突变体大幅度下降。Sbpho2突变体在地上部分积累了大量的磷元素，剑叶中磷的浓度较野生型约7倍，而在根部中，磷含量无显著变化。表明SbPHO2参与了磷元素从根部到地上部分转运的调控。且Sbpho2突变体剑叶中还积累了较多的Na、Fe、K、Mg等营养元素，同时总N、总Ca的含量有所下降。缺磷实验表明，缺磷可以缓解该突变体叶尖坏死的症状。且Sbpho2突变体在缺磷条件下主根及不定根响应低磷伸长的能力更强，表明SbPHO2参与了低磷下，高粱根系构型的改变。野生型和突变体Sbpho2突变体在缺磷处理七天，分别取地上部分及根部分析基因表达谱，结果表明，在突变体中，正常条件以及缺磷处理条件下，许多磷吸收、转运以及相关调控基因的表达都是上调的，尤其是在低磷诱导后，这些基因的诱导倍数较野生型更高。Sbpho2突变体在正常条件下，磷饥饿诱导的一些特征反应，诸如增强磷酸酶表达、核酸酶表达、脂类代谢等相关基因都在突变体中有上调。本研究表明SbPHO2是重要的磷饥饿信号途径调控基因，参与了高粱磷饥饿响应的多方面调控。