新基因Mipu1抗心肌细胞凋亡的分子机制研究

近年申请者所在实验室采用抑制消减杂交技术筛选并克隆了一个大鼠心肌缺血预适应诱导表达上调新基因Mipu1，并发现Mipu1在心肌缺血、氧化应激时表达明显增加，具有明确的心肌细胞保护功能。但目前对其保护机制尚不明了。申请者最近确定了新基因Mipu1是转录因子，并确定了其特异的DNA结合序列。此外，通过生物信息学软件发现多个促凋亡基因启动子含有Mipu1结合位点，结合对国内外相关文献的深入分析，筛选出10个可能受Mipu1调节并参与心肌缺血缺氧损伤的促凋亡基因。在上述研究基础上，本项目拟采用EMSA、target detection assay、Western blot、ChIP、报告基因等目前国际上研究基因调控和基因功能的新技术，从对促凋亡基因的调控系统深入地探讨Mipu1的心肌细胞保护机制，以进一步揭示心肌内源性保护的分子机理，为相关心血管疾病的防治提供新的思路。

本项目根据新基因Mipu1对心肌细胞的保护与促生长作用及其作为转录因子的特点，对其抗心肌细胞凋亡的功能与分子机制进行了深入的研究。采用过氧化氢与TNF-α诱导H9c2的凋亡作为细胞模型，流式细胞术、细胞核染色观察及Caspase3测定等多个凋亡检测指标，发现Mipu1能显著地抑制过氧化氢与TNF-α诱导的H9c2细胞的凋亡。生物信心学分析了多个促凋亡基因的启动子区，将启动子区含有Mipu1结合位点的促凋亡基因进行深入研究。首先体外克隆Bax启动子DNA序列，缺失突变制备融合蛋白，采用target detection assay研究发现，Mipu1最后的六个锌指是其与DNA结合位点结合的结构域；采用免疫共沉淀发现，Mipu1能与KAP-1相互作用， KRAB是其与KAP-1相互作用的结构域。采用target detection assay发现，Mipu1纯化蛋白能与Bax启动子在体外结合；采用ChIP研究发现，Mipu1能在细胞内与Bax启动子结合，但这种结合作用需要过氧化氢的介导；采用报告基因结合突变分析发现，Mipu1能显著抑制Bax启动子的活性，并且这种抑制作用依赖于Mipu1结构的完整性及其结合位点；采用RT-PCR(real-time PCR)及Western blot分析发现，过氧化氢能诱导Bax的表达，但其表达受Mipu1的抑制。这些研究结果说明，Bax是Mipu1的下游基因，受Mipu1的直接调控。采用类似的策略，我们进一步研究发现，Bid和Fas也受到Mipu1的直接调控，是其下游靶基因。除此之外，我们还发现抗凋亡基因Bcl-2的表达能被Mipu1促进，但其机制尚不清楚。综合以上的研究结果，本项目有如下发现：1、Mipu1最后六个锌指是其DNA结合结构域；2、Mipu1是一个抗凋亡蛋白，能抑制过氧化氢等诱导的凋亡；3、Bax、Bid和Fas是其下游基因，其表达受到Mipu1的抑制，并且促进Bcl-2的表达。因而Mipu1的抗凋亡功能主要是通过其对促凋亡基因Bax、Bid及Fas的抑制作用与抗凋亡基因Bcl-2表达的促进作用实现的。本项目的研究提示Mipu1是潜在的心肌细胞保护基因，可能在心肌内源性保护及缺血/缺血-再灌损伤中发挥了重要作用。