基于转录组及代谢组学的斑蝥素生物合成途径研究

Cantharidin is a defensive toxin produced by blister beetles (Coleoptera: Meloidae), with potential insecticidal and antibacterial activities. It will be a promising biogenic pesticide. However, the rare cantharidin source limits its application. Knowledge of the biosynthetic pathway of cantharidin will enable us to enhance its synthesis, for example using metabolic pathway engineering. Our previous studies have revealed that cantharidin is de novo synthesized by MVA pathway, and the synthetic pathway is extended to the juvenile hormone acid alcohol. Yet there is no information about the related enzymes and precursors in the downstream of the pathway. In this proposal, tissue culture assay will be performed to determine where the cantharidin was produced in vivo. The differential expressed genes and metabolic components between the cantharidin-produced tissue in male and the corresponding tissue in female will be carried out by transcriptome and metabolome profiling. The genes involved in cantharidin biosynthesis will be determined by gene expression analysis and RNAi. The function of cantharidin biosynthetic genes will be verified through recombinant expression and in vitro enzymatic reaction to clarify the enzyme catalyzed steps of the pathway. This study will provide insights into the comprehensive understanding of the molecular regulatory mechanisms of cantharidin synthesis, and provide important theoretical and practical guiding for the synthesis of cantharidin by combinatorial biosynthesis method.

斑蝥素是芫菁科昆虫体内的一种防御性毒素，具有很强的杀虫和抑菌活性，作为生物源农药应用前景广阔,但斑蝥素纯品的来源是其产品开发的首要难题。弄清斑蝥素的生物合成途径，将对人工合成斑蝥素具有重要的指导意义。本课题组前期研究确定斑蝥素是由甲羟戊酸途径从头合成，并将合成途径延伸定位到了保幼激素酸醇，但再往后的下游合成途径相关酶和前体未知。本研究拟继续以中华豆芫菁为材料，通过前体与离体组织共培养等方法确定斑蝥素合成组织；基于转录组学和代谢组学技术对斑蝥素合成组织的差异表达基因和差异代谢成分进行初步筛选；采用基因表达、RNAi等方法确定斑蝥素合成相关基因；基于差异代谢成分结构，通过基因重组表达及体外酶活反应确定基因功能，明确相关酶催化步骤，阐明斑蝥素中下游生物合成途径及其机理。本项目的实施可为全面认识斑蝥素合成的分子调控机制奠定基础，并对今后的生物工程应用提供科学依据。

斑蝥素是芫菁科昆虫体内的一种防御性毒素，具有很强的杀虫和抑菌活性，作为生物源农药应用前景广阔。弄清其生物合成途径，将对人工合成斑蝥素具有重要的指导意义。本项目以中华豆芫菁为研究对象，利用同位素标记前体与组织共培养方法确定斑蝥素合成组织为脂肪体。通过PacBio三代测序平台对其进行全基因组测序，获得151.88Mb的基因组，注释得到12520条高质量编码蛋白基因集。比较基因组学分析获得中华豆芫菁45个快速扩张基因家族，富集分析发现其包括法尼酸甲基转移酶活性、保幼激素甲基转移酶活性、倍半萜生物合成等活性。比较转录组学分析，共鉴定到2798个雌雄差异表达基因，其中244个在4个时期雄虫脂肪体中均上调表达，分析发现这244个基因主要参与代谢和催化反应过程，并富集到萜类碳骨架代谢和次生代谢物生物合成等通路。WGCNA分析发现，salmon模块的样本表达模式与斑蝥素变化趋势相符，且已知的10个斑蝥素合成关键酶基因均在该模块中，综合分析，确定16个斑蝥素合成候选基因。比较代谢组学分析共鉴定到902种雌雄差异代谢物，雄虫脂肪体公共上调的差异代谢物为92种，KEGG分析发现这些代谢物显著富集到2-氧代羧酸、C5分支二元酸、生物素代谢以及赖氨酸的合成与降解通路。脂肪体转录组学和代谢组学联合分析最终确定phyh、CYP6BK33、CYP4TT1、cox5A、CYP9E2和DHRS4作为后续基因功能验证的目的基因。克隆并获得了6个候选基因的全长cDNA序列，qRT-PCR结果表明，这6个基因在中华豆芫菁交尾后1、3和5d雄虫及脂肪体组织均高表达,且其表达量与斑蝥素含量均正相关。对中华豆芫菁交尾后雄虫的6个候选基因进行了RNAi，干扰效率达85%以上。而且EcCYP4TT1、Ecphyh、EcDHRS4、EcCYP9E2和Eccox5A成功干扰后抑制了斑蝥素合成，抑制率达41%以上，最高可达83%；而EcCYP6BK33干扰后不影响斑蝥素的合成。说明EcCYP4TT1、Ecphyh、EcDHRS4、EcCYP9E2和Eccox5A参与了斑蝥素的生物合成。本项目获得的基因和代谢物数据,可为表征与候选基因相关性高的未知代谢物提供资料;为全面认识斑蝥素合成的分子调控机制奠定基础，并对今后的生物工程应用提供科学依据。