鼠疫耶尔森氏菌致病性相关蛋白与人蛋白相互作用网络的研究

本研旨在初步构建鼠疫菌毒力相关蛋白和人蛋白之间的相互作用网络，发现一批重要的鼠疫菌与人蛋白相互作用，为鼠疫菌致病机制研究、预防和治疗手段的研究奠定基础。根据鼠疫菌致病机制、基因组注释信息、鼠疫菌比较基因组学、鼠疫菌在不同刺激条件下的表达谱、血清抗体谱、蛋白芯片筛选的蛋白相互作用确定可能和宿主相互作用的鼠疫菌蛋白150个（占整个基因组的3.75%）。利用Gateway克隆技术构建鼠疫菌诱饵蛋白，通过酵母双杂交技术筛选预制的人脾脏cDNA文库。对筛选到的猎物分子测序和序列比对分析确定其身份。用Co-AP技术对筛选到的相互作用对进行验证，并对酵母双杂交数据的可靠度给出客观评价。根据得到的蛋白相互作用对初步构建鼠疫菌蛋白与人蛋白相互作用的网络，并对网络进行拓扑结构和功能分析。挑选1～2对相互作用对进行较为深入的研究，初步阐明该相互作用在鼠疫菌感染人体的过程中发挥的作用。

本研究采用高通量酵母双杂交技术，以鼠疫菌毒力相关蛋白为诱饵筛选人脾脏cDNA文库，获得大量的鼠疫菌-人蛋白相互作用对。在充分挖掘酵母双杂交数据及文献报道的基础上构建了包含200多个鼠疫菌-人蛋白相互作用的网络，确定一批重要的鼠疫菌与人蛋白相互作用，为研究鼠疫菌致病机制和防治策略奠定基础。我们随机挑选20多对筛选得到的相互作用进行GST pull down验证，有70%的相互作用能得到验证，表明我们获得的酵母双杂交数据集可靠度较高。通过对鼠疫菌-人蛋白相互作用网络的拓扑学和功能的深入研究，发现了鼠疫菌倾向于攻击人蛋白相互作用网络中的中心蛋白；鼠疫菌作用于重要的免疫信号通路，如Toll样受体通路，白细胞跨内皮细胞转移通路，MAPK通路，细胞骨架调控通路等，这些通路已经被证实与鼠疫菌的致病性密切相关。目前细菌-人蛋白相互作用网络的报道还十分少，在本项目执行期间美国国立卫生研究院过敏和感染疾病研究所生物防御蛋白组研究中心开展了相关研究。他们采用酵母双杂交随机片段克隆和筛选，然后对结果进行处理，以确定有可能与人体蛋白发生相互作用的候选鼠疫菌蛋白，并没有对筛选出来的相互作用数据集的可靠性进行验证实验。而本研究采用单个诱饵筛选文库的方法构建鼠疫菌-人蛋白相互作用网络，并且对筛选到的相互作用进行了验证。通过与文献报道的其它病原-宿主相互作用网络的比较分析研究，我们发现部分与鼠疫菌蛋白（16/109）相互作用的人蛋白同样也与一些病毒蛋白（EBV和HCV）发生相互作用，反映了不同病原往往以一些重要人蛋白质为感染过程中的共同靶标，这些蛋白有可能成为抗感染策略的新的靶标分子。在此基础上我们以鼠疫菌效应蛋白YpkA和YopK为研究靶标，对这两个效应蛋白与宿主靶蛋白的相互作用进行了深入的研究，进一步的研究结果将逐步揭示这些相互作用在鼠疫菌致病过程中发挥的作用。