鼠疫耶尔森氏菌若干蛋白与NF-κB通路p65分子作用机制的研究

鼠疫耶尔森氏菌能在感染的早期有效的抑制宿主的免疫响应、诱导细胞凋亡，从而逃避宿主的清除机制。NF-κB是宿主免疫系统重要作用的抗感染信号通路。我们以鼠疫菌蛋白为诱饵筛选人脾脏cDNA文库，发现鼠疫菌蛋白YPO3877，YPO2940，YscU，YscL和SycE能与NF-κB的p65亚基相互作用。经过GST pull down试验和荧光素酶报告基因实验已经部分的证实了鼠疫菌蛋白和p65的相互作用，并发现一些蛋白能够明显抑制TNF-α诱导的NF-κB活化。本研究将构建p65不同结构域的截短体，确定鼠疫菌蛋白与p65相互作用的结构域；构建鼠疫菌相应的突变株，分析这些蛋白影响NF-κB信号通路活化的分子机制以及在鼠疫菌致病机制中的作用，并分析多个鼠疫菌蛋白与p65相互作用之间的共性、特性和协同性，探讨其在细菌致病机制中的普遍意义。

鼠疫耶尔森氏菌是致病力强的烈性病原菌，能在感染早期有效抑制宿主的免疫响应，从而逃避宿主的清除机制。NF-B是宿主免疫系统重要作用的抗感染信号通路。我们以鼠疫菌蛋白为诱饵筛选人脾脏cDNA文库时发现鼠疫菌蛋白 YPO3877，YPO2940，YscU，YscL和SycE能与NF-kB的p65亚基相互作用。本研究通过突变菌株构建及毒力评价、荧光素酶报告基因实验、鼠疫菌蛋白与NF-kB p65亚基相互作用结构域的确定、β-半乳糖苷酶降解实验开展研究。在体外GST pull down实验验证，五种蛋白都能与p65亚基相互结合。构建p65不同的截短体，用GST pull down实验进一步确定相互结合的结构域，结果显示SycE能与p65的RHD结构域的C端结合，而与p65的C端的转录结合结构域没有结合。经皮下途径攻毒小鼠，结果显示ypo2940和ypo3877的毒力无明显改变。SycE对TNF-诱导的NF-B活化有明显的抑制作用，且抑制活性有SycE表达量的依赖性；YPO3877，YPO2940，YscS，YscL对TNF-诱导的NF-B活化没有明显的抑制作用或是没有明显的剂量依赖性。基于TEM报告基因的蛋白转运实验证实SycE不能进入宿主细胞，因此SycE与p65分子的相互作用可能只是物理性的。综上所述，实验计划中选定的几个蛋白与p65的相互作用可能仅限于物理性的，未找到很强的功能表型。