NK细胞亚群在小鼠心脏移植慢性排斥中的作用机制

With significant progress in the study of acute rejection, allograft chronic rejection is becoming the main challenge. A large number of animal experiments and clinical data indicate that NK cells play an important role in chronic solid organ rejection, but the mechanism is not clear. Accumulated evidence have shown that NK cells are constituted by subsets with distinct phenotype and function, each subset may play a role in the process of chronic rejection through its unique mechanism. On the basis of our preliminary work, this research project is to use a model of murine cardiac allograft chronic rejection with CD8-depleted CD4 gene knockout mice as recipients, to detected the phenotypes and location of NK cells, B cells, macrophages and other highly related cells at different time points by means of the techniques such as immunohistochemistry and flow cytometry; to qualitatively and quantitatively measure and locate the related cytokines through RT-PCR,ELISA, flow cytometry and immunohistochemistry; in combine with selective cell depletion or protein blockade with monoclonal antibody, to dissect the cellular and molecular interactions between NK cells and the related cells, revealing the cellular and molecular processes of NK cell subsets in chronic rejection, and providing new grounds for clarifying the mechanism of chronic solid organ rejection.

伴随急性排斥反应研究的显著进展，慢性排斥正成为移植免疫的主要难题。大量动物实验及临床资料表明，NK细胞在实体器官慢性排斥反应中起重要作用，但其中机理尚未明确。已有研究显示NK细胞由多个表型和功能存在着明显差异的亚群构成，不同亚群在移植排斥过程中可能会通过不同机制发挥作用。本研究拟在前期工作基础上, 利用CD4基因敲除小鼠为受体建立异品系心脏移植慢性排斥模型，在不同时间点通过免疫组织化学和流式细胞术等方法确定NK细胞及B细胞、巨噬细胞等相关免疫细胞的表型和部位；通过RT-PCR及免疫组织化学和流式细胞术等方法对相关细胞因子进行定性、定量和定位检测；结合运用单克隆抗体选择性细胞清除或蛋白阻断等方法，剖析NK细胞及细胞因子与其主要相关细胞间的关系，揭示NK细胞亚群在慢性排斥反应中的细胞与分子作用过程，为阐明实体器官慢性排斥反应机制提供新的依据。

尽管急性排斥反应研究已取得显著进展，慢性排斥仍然是移植免疫的主要难题。参照近些年出现的新进展并结合考虑经费与国内小鼠资源以及本校动物饲养条件, 我们利用亲子代皮肤移植模型、SCID和NOD-SCID小鼠心脏移植、木瓜蛋白酶诱导小鼠肺部炎症模型及NK细胞与巨噬细胞相互作用的体外实验等,对NK细胞及巨噬细胞在慢性排斥过程中的作用及其亚群特性、NK细胞与重要相关免疫细胞的相互作用等进行了研究。通过使用免疫组织化学和流式细胞术等方法对NK及巨噬细胞等相关免疫细胞的部位、表型及相关细胞因子进行定性或定量检测，我们确认了NK细胞的存在并非导致慢性排斥发生的充分条件;探索并获得了优化的NK细胞分离提纯和维持细胞活性的体外培养方法，为体外研究NK与巨噬细胞相互作用创造了条件;结合运用单克隆抗体选择性细胞清除及细胞传输等方法，研究了NK细胞与ILC2s间的相互作用并确认了NK细胞在炎症早期阶段对ILC2s的负调控作用，这意味着ILC2s不大可能参与NK细胞相关的慢性排斥过程；通过组织病理学检测，我们发现了进展中血管内膜慢性排斥病变，这为我们深入研究内膜增生过程中的细胞学改变提供了极佳样本。另外我们还发现虽然受者移植物外器官NK及巨噬细胞比例不能反映移植物慢性排斥变化，但NK细胞及巨噬细胞亚型可能与慢性排斥病变相关；尤其是我们观察到的NK细胞与巨噬细胞因子间相互作用，会有助于阐明NK细胞与巨噬细胞在慢性排斥过程中的相互作用机制。我们的发现，尽管有些数据需要进一步验证，将会为揭示NK细胞亚群在慢性排斥反应中的细胞与分子作用过程进而更好地了解实体器官慢性排斥反应机制提供新的依据。