干细胞外泌体作为新型基因靶向载体用于缺血性脑卒中治疗的基础研究

The development of novel drug/gene delivery systems is a hot topic in the field of Pharmaceutics. Within the past decade, extracellular vesicles have emerged as important mediators of intercellular communication, being involved in the transmission of biological signals between cells to regulate diverse range of biological process. These extracellular vesicles （especially exosomes）are likely to have great applications in nucleic acid drug delivery since they appear to have multiple advantages, such as good biocompatibility and ability to cross biological barriers (eg. BBB), over current artificial delivery systems. This project will focus on mesenchymal stem cell (MSC)-derived exosomes, and ultimately develop MSC-exosomes as novel targeting gene delivery carrier. This process includes optimization and improvement of protocols of isolation, purification, characterization and application, methods of targeting modification and drug loading. Furthermore, the targeting efficiency and therapeutic effect will be evaluated on animal models of ischemic stroke, and a cell-free therapy will be established. The insight into feasibility of development of MSC-exosomes as targeting gene delivery carrier will lay theoretical and experimental foundation.

新型基因传递体系的研究是药剂学领域重要的研究方向。在过去的十年中，研究发现细胞外泌体（exosomes）在细胞间的交流中起着重要的作用。外泌体具有很多天然的优势，如生物相容性好，能穿过一些体内的生物屏障如血脑屏障等，因此很有可能在核酸类药物递送中具有巨大的应用潜力。本研究将基于课题组研究基础，以骨髓间充质干细胞（MSC）来源的外泌体为研究对象，优化完善其分离、纯化、鉴定以及应用的方法体系，建立MSC-exosomes靶向修饰和基因药物加载新方法，进一步地，在缺血性脑卒中模型上验证携载siRNA的MSC-exosomes的靶向效率、治疗效果及安全性，将MSC-exosomes发展成为新型的靶向基因药物递送载体。通过对exosomes作为靶向基因载体的可行性进行基础性深入研究，以期建立基于细胞外泌体的基因传递与治疗方法，扩展靶向传递体系的范围并为其应用奠定理论与实验基础。

以天然靶向功能生物载体的理念，将干细胞分泌的外泌体（exosomes）用于缺血性脑卒中的治疗。Exosomes负责细胞间信息物质传递，携载具有神经生长治疗作用的基因和生物活性因子，能靶向输送至脑部缺血区域。尝试通过对干细胞的低氧培养或氧化铁纳米粒共孵育间接修饰其分泌的exosomes，对exosomes进行脑靶向肽修饰，改变exosomes靶向能力。最终全面评估exosomes作为脑靶向生物载体的可行性及其针对缺血性脑卒中的治疗前景。.通过本项目研究成功从神经干细胞（neural stem cell，NSC）培养液中提取exosomes，通过透射电镜，粒径检测，western blot标志蛋白检测对提取所得囊泡进行了鉴定，证明成功提取到exosomes。对NSCs进行不同时间的低氧培养，或将氧化铁纳米粒加入NSCs中进行共培养，其分泌的exosomes形态不受影响，表面CXCR4表达得到提升。用脑靶向肽与exosomes共孵育，将肽插入exosomes膜表面，改变exosomes靶向性。将exosomes标记荧光后通过尾静脉移植到MCAO小鼠体内后，小动物活体成像以及组织切片结果显示，exosomes拥有与NSCs相似的靶向能力。而靶向修饰后的exosomes也能向脑部缺血区域靶向分布。进一步地，分别检测了exosomes尾静脉移植入MCAO小鼠体内后的疗效。移植治疗后，小鼠生存率得到了极大提升，提升幅度远大于NSCs移植治疗的结果。mNSS评分，粘贴物去除实验结果，水平爬梯测试结果均显示exosomes具有较好的神经修复的作用。.本项目成功提取NSCs分泌的exosomes，其对缺血性脑卒中病灶组织有很强的靶向性，作为天然靶向功能生物载体，携载具有神经生长治疗作用的基因和生物活性因子，拥有与NSCs相似的靶向能力和治疗功能，在缺血性脑卒中的治疗中显示了很好的应用潜力。通过本项目研究已发表论文10篇，其中SCI收录文章9篇，综述2篇，最高影响因达21.9，获得授权发明专利1项，受邀做会议报告9次，培养研究生7名。并获得2016国家自然科学基金国际合作重点项目（81620108028 基于干细胞的新型基因靶向传递系统若干关键问题研究）的资助。