高效载体共导入肿瘤抗原和趋化性细胞因子受体提高树突状细胞体内定位及抗原提呈能力的研究

采用树突状细胞（DC）进行肿瘤的免疫治疗被寄予厚望，但因其通常需要在体外进行基因重组并回输体内，因此体外基因转染效率及在体抗原提呈效率成为治疗成功与否的关键。本项目将针对树突状细胞表面性质，构建以甘露糖-胆固醇和精胺-右旋糖苷为骨架的受体介导载体，考察其对树突状细胞的转染、毒性及其机制。并进一步地，结合免疫学最新研究进展，通过高效载体将肿瘤相关抗原及促进树突状细胞淋巴聚集的特异趋化性细胞因子受体CCR7在体外进行基因重组，从而提高树突状细胞向淋巴部位的定向分布和抗原提呈效率。本项目通过创新性地结合材料、制剂以及免疫学的新进展及新方法，将有望大大推进基于DC疫苗的肿瘤预防/治疗研究领域。同样的，能对处于终末分化期的树突状细胞产生高效转染的载体的成功构建预计将可方便地应用于更广的研究领域，促进诸如干细胞、神经细胞、平滑肌细胞基因重组等的研究，具有重要的科学意义和广阔的应用前景。

本研究成功合成和表征β-聚氨酯（Poly β-amino ester, PBAE），壳聚糖-聚醚酰亚胺（Chitosan-Polyetherimide,CP）及精胺-右旋糖酐（Spermine-Dextran,SD）三种非病毒基因转染材料。通过孵育法成功制备PBAE,CP和SD的基因复合纳米粒。TEM 观察表明SD/DNA复合物是结构均一类球形复合纳米粒。通过携载报告基因对细胞株进行转染结果表明三种材料载体基因复合物对于肿瘤细胞株均有良好的转染活性。荧光显微镜及激光共聚焦显微镜结果表明经三种非病毒载体携载的DNA均能成功进入DC胞浆及细胞核。三种非病毒基因转染材料携载EGFP报告基因转染实验结果表明，与市售试剂Lipofectamine2000（Lipo）/DNA复合物相比，CP与SD的基因复合纳米粒对DC具有较佳转染效率及生物安全性，对于后者，其入胞抑制实验结果显示SD/DNA在入胞抑制剂NaN3及MβCD存在下入胞量减少，证明其入胞途径为能量依赖性的小窝-脂筏介导的内吞途径。经SD携载趋化性细胞因子受体CCR7质粒复合物转染的DC在体外迁移实验中较Lipo基因复合物转染DC显示出更高的迁移活性；进一步，在体内迁移实验中亦显示出更明显的淋巴趋向归巢现象。在ex vivo实验中，经SD携载的黑色素瘤抗原gp100质粒转染的DC疫苗具有良好的免疫抑制黑色素实体瘤效果，而经CP携载的gp100抗原质粒转染的DC疫苗免疫抑瘤活性较差。进一步的DC疫苗免疫实验中，经SD携载抗原质粒gp100和CCR7质粒转染的DC疫苗组产生了显著的抑瘤效果并提高荷瘤小鼠生存率。通过本研究表明经筛选SD携载的DNA纳米复合物，对于DC具有良好的转染活性，转染目的基因后能够提高DC的抗原表达能力及迁移活性，体内免疫预防实验证明经SD转染的DC疫苗免疫对预防和治疗癌症具有很好的应用潜力。