免疫细胞及免疫微环境在角膜植片慢性失功发生过程中作用机理研究

Chronic corneal allograft dysfunction ( CCAD ) is one of the main risk factors of long-term graft failure after corneal transplantation. In the early study funded by National Nature Science Foundation of China, our study group found the sensitized T cells, macrophages (MФ) and relative immune microenvironment change (TGFβ change abnormaly) play an important role in graft damage and fibrosis during CCAD, but the pricise mechanism still remains unclear. In this proposal, we will using transgenic mouse strain (Bonzo and Mafia mice) and noninvasive confocol microscopy to identify and understand the roles of T cells, MФ, and the immune microenvironment in CCAD: 1) Study the role of T cells in CCAD by visualizing T cells distribution and motility in vivo of Bonzo mice, T cells depletion technique, adoptive transfer of T cells into Rag knockout mice, and modulation of T cells by ex vivo-expanded regulatory T cells (Treg). 2) Study the role of MФ in CCAD by visualizing MФ distribution and motility in vivo of Mafia mice and MФ depletion techenique. 3) Study the role of T cells-TGFβ-Smad pathway and immune microenviroment during CCAD development.

角膜植片慢性失功（CCAD）是影响角膜移植术后植片远期存活最主要的危险因素之一。课题组在前期国科金资助下成功建立小鼠CCAD模型，且发现T细胞、巨噬细胞（MФ）等免疫细胞及其导致的免疫微环境改变（TGFβ等异常）引起移植物损害和纤维增生在CCAD发展过程中发挥了重要病理作用，但具体机理不明。因此本研究拟在前期研究的基础上，研究T细胞、MФ以及相关微环境改变对角膜植片远期存活的影响，明确免疫因素在CCAD过程中的作用机理：1）通过活体观察Bonzo小鼠植片内T细胞分布和运动、T细胞选择性清除、Rag小鼠体内定量输入T细胞、及调节性T细胞调节T细胞功能等方法研究T细胞在CCAD过程中发挥的作用；2）活体观察Mafia小鼠植片内MФ分布和运动、选择性清除MФ等方法研究MФ在CCAD过程中的作用；3）验证T细胞-TGFβ-Smad通路对内皮细胞分泌功能的影响，以及在CCAD发生过程中的作用及机理。

角膜植片慢性失功(chronic corneal allograft dysfunction, CCAD)是角膜移植术后远期植片失败的最主要原因，但其病理机制尚不明确。本课题主要围绕免疫微环境以及免疫细胞与角膜植片慢性失功的关系，主要开展以下工作并取得一定的研究进展：(1)通过对临床上因慢性失功而需要做二次移植手术取下的角膜植片样本进行分析发现，慢性失功角膜植片存在衰老和慢性炎症表型，提示角膜植片慢性炎症微环境可能通过诱导角膜内皮细胞衰老参与CCAD的病理过程；（2）在临床发现“慢性失功角膜植片高表达TGF-β1”的基础上，借助体外实验研究其在诱导角膜上皮细胞衰老中的作用，研究发现TGF-β1可通过RNA应激反应激活NF-κB参与上皮细胞衰老过程；（3）在临床发现慢性失功角膜植片高表达NLRP3的基础上，主要借助体外角膜上皮细胞模型发现：TGF-β1可通过炎症小体NLRP3非依赖途径诱导角膜上皮细胞衰老；（4）借助小鼠角膜植片慢性失功模型以及体外角膜内皮细胞培养模型分析了角膜植片慢性微环境对角膜内皮细胞衰老的影响，研究表明：慢性失功角膜植片内皮细胞存在衰老表型，TGF-β1可诱导角膜内皮细胞衰老及衰老相关分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype, SASP）；（5）通过Mafia转基因小鼠模型活体观察免疫细胞对角膜植片存活的影响，研究发现：清除巨噬细胞可有效延长角膜植片存活时间，巨噬细胞和T细胞均与免疫排斥反应密切相关。.本课题系列研究初步探讨了角膜植片免疫微环境以及免疫细胞对角膜植片衰老以及存活的影响，进而揭示了CCAD的病理机制并为临床防治CCAD提供理论基础。本系列研究一共发表文章12篇，其中SCI论文9篇。