磷脂酶D基因敲除对烟曲霉生物学性状及致病性的影响

烟曲霉是重要病原真菌之一，可引发侵袭性肺曲霉病，其发病率不断上升，致死率很高。烟曲霉许多基因与其致病性密切相关，但关键致病因子尚不清楚。磷脂酶D是细胞内重要功能蛋白，催化水解细胞膜主要成分磷脂酰胆碱生成第二信使磷脂酸，与细菌、真菌等病原体的侵袭力密切相关。研究发现，假结核棒状杆菌及病原真菌白色念珠菌的磷脂酶D基因缺失后毒力明显减弱，但磷脂酶D在烟曲霉中的具体功能仍不清楚。我们已成功构建烟曲霉磷脂酶D基因敲除株及回补株，初步研究发现敲除株毒力显著下降。本项目拟进一步研究磷脂酶D基因敲除对烟曲霉形态及生理代谢等生物学性状的影响，并利用不同类型细胞和免疫缺陷小鼠模型研究磷脂酶D对烟曲霉致病性的影响，最后初步分析磷脂酶D基因敲除后烟曲霉基因转录和蛋白表达差异情况。这将较为全面地揭示磷脂酶D在烟曲霉致病性中的重要作用，丰富对烟曲霉致病机制的认识，为预防和控制烟曲霉感染提供新的理论依据和可能药物靶标。

近年来，由烟曲霉引起的曲霉病发病率不断上升，尤其是侵袭性肺曲霉病致死率很高。研究表明，烟曲霉毒力效应可能是多基因调控的结果，但关键致病因子尚未发现。磷脂酶D（phospholipase D，PLD）是细胞内重要的信号分子，在生物界广泛表达，其在病原生物，如细菌、真菌等感染宿主过程中发挥了非常重要的作用。但是，其在烟曲霉中发挥何种作用尚不清楚，国内外未见报道。在本项目中，我们采用根癌农杆菌介导基因敲除的方法首次将烟曲霉pld基因成功敲除，并构建其回补株。研究主要发现，pld基因敲除显著降低烟曲霉细胞内外的PLD活性但不影响孢子形态特征、出芽、生长和生物膜的形成。此外，pld基因敲除对烟曲霉在基础培养基上生长时的抗氧化能力无影响而显著抑制其在酵母葡萄糖琼脂培养基上的抗氧化能力，pld基因敲除对烟曲霉耐细胞壁干扰剂的能力、耐渗透压、耐碱性环境能力无显著影响。烟曲霉pld基因敲除不影响孢子对肺上皮细胞的粘附作用，但抑制其内化侵入上皮细胞的能力而对巨噬细胞的吞噬能力无影响。外源加入PLD水解产物PA可以恢复烟曲霉侵入上皮细胞的能力。用PLD活性抑制剂预处理烟曲霉孢子，可以显著降低其内化侵入上皮细胞的能力而对巨噬细胞吞噬能力无影响。动物实验表明pld基因敲除可减弱烟曲霉对氢化可的松免疫抑制小鼠的毒力而对环磷酰胺免疫抑制小鼠的毒力无影响。最后，我们利用转录组测序的方法研究发现烟曲霉pld基因敲除株侵染肺上皮细胞后，与野生株相比会使上皮细胞内与细胞生存、增殖和细胞间连接以及细胞内相关信号通路的磷酸化功能相关的基因上调，而下调的基因与细胞的天然免疫等功能密切相关。也发现与烟曲霉野生株相互作用8h的肺上皮细胞中大部分上调的基因与免疫反应、趋化反应和炎症反应有关，而下调表达基因主要富集与发育、内稳态及离子转运相关的生物学功能。我们选择一些上下调基因进行qRT-PCR验证，结果与转录组测序结果一致。此外，qRT-PCR结果显示，与野生株相比，烟曲霉pld基因敲除株刺激肺上皮细胞内IL-8转录的能力显著下降。综上所述，该研究结果揭示了PLD可能是烟曲霉的重要毒力因子之一，加深了人们对烟曲霉致病力的了解，拓宽对烟曲霉多基因调控功能网络的认识，为防控和治疗烟曲霉感染提供了可能的药物靶标。