基于Cyclen的稀土金属配合物荧光探针的设计、合成及其在活细胞成像中的应用和机制研究

Rare earth metal complexes have large Stokes shift, characteristic emission spectrum, long luminescence lifetimes and stable emission, low chemical activity in organisms. Taking use of 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane (Cyclen) as the framework for design of rare earth complexes, we realized the live cell imaging of key cell cycle regulators such as CyclinA, Plk1. On this basis, the project designs a leading complex – HGEu001 that capable of specific targeting to eukaryotic cell primary cilium. Primary cilium is a slender structure protruding from the cell surface, and regulates the cellular stress, cell division, or stem cell polarity, etc. Without cell transfection or antibody labeling, we realized the live cell imaging and real-time tracking of cilia. Using HGEu001 as a molecular probe, we aim to reveal the protein targets of the complex and the way of combination, and also perform the real-time observation and three-dimensional imaging of primary cilium in the situation of cellular stress or lateral movement. We will further explore the crystal structure of the complex with its target protein, understand the way of binding and the residues involved. With the above work, we may reveal a possible principle for rational design of rare earth complex, and contribute to the optimization of the rare earth complexes for specific targeting and responsive emission in living cells that in hope of providing new ideas and design methods for biomedical research.

稀土金属配合物发光具有大斯托克位移，发射光谱特异易识别，发光稳定且寿命长，生物体内化学活性低等优点。以1，4，7，10-四氮杂环十二烷（Cyclen）为骨架设计稀土配合物，我们实现对细胞周期关键调控蛋白CyclinA， Plk1等特异靶点的活细胞显微成像。在此基础上，本项目设计的先导配合物HGEu001能特异地靶向真核细胞的纤毛——细胞表面向外伸出的细长突起结构，与细胞应激，细胞分裂，干细胞极性等相关。在不需要细胞转染或抗体标记的情况下，实现纤毛的活细胞成像和实时追踪。以HGEu001为分子探针，我们旨在揭示该配合物的纤毛蛋白靶点和结合方式，实现线毛在细胞应激下的生长，侧向等实时观察和三维立体成像，并探究配合物与靶点蛋白结合的晶体结构，明了结合区域的关键基团和作用方式，揭示可能的设计原理，并以此改进和优化配合物，为稀土配合物应用于活细胞特异靶点的结合与显微成像及生物医学功能研究等提供新思路

本项目设计合成了特异定位于动物细胞原纤毛的成像分子HGEu001, Eu-L等，并在NIH-3T3，hTERT-RPE等体外培养的细胞中进行活细胞实时成像。上述分子是以1，4，7，10-四氮杂环十二烷（Cyclen）为分子骨架的稀土金属配合物，连接了以乙炔基吡啶为主基团作为发色基团。在模型细胞NIH-3T3等中得到了原纤毛的活细胞成像，显示与常规的GFP-IFT88或Ac-tubulin等原纤毛蛋白标志物的良好共定位。我们证实HGEu001具有良好的水溶性，生理浓度下无细胞毒性，以及良好的原子吸收和发射光谱，双光子成像光谱。有趣的是，作为对照分子的HGEu002与HGEu001只在侧链的发色团上相差一个-CH3，但是却完全不具有活细胞原纤毛的定位能力，说明侧链基团对HGEu001的特异细胞定位具有决定性作用。我们通过Biotin亲和吸附，化学共价偶联并结合高分辨质谱的方法，鉴定了actin是HGEu001的靶向分子，而且氨基酸基序DLYANTVLSGGTTMYPGIADR是直接负责与HGEu001的结合。体外表达纯化的actin蛋白可以被HGEu001特异结合，在SDS-PAGE中显示出显著的电泳迁移滞后条带。此外，我们也分析septin，RILPL1，DPYSL2等原纤毛蛋白成员也可能参与HGEu001与原纤毛的结合。这些结果在阐明HGEu001如何定位到原纤毛的同时，也有助于理解actin在原纤毛组装中的作用。在此基础上，我们深入设计并扩展了HGEu001系列分子，得到了Eu-42，Eu-61，Eu-119等系列分子，都具有良好的水溶性和激发发射光学性质。本项目的上述结果开发了能进行活细胞原纤毛实时成像的系列分子，克服了常规生物成像方法的局限，并验证了其靶点作用方式，对后续研发新型原纤毛成像分子如不依赖稀土金属的普通化学小分子但更易合成和推广等具有重要的借鉴和参考意义。