靶向C-CBL蛋白的荧光标记多肽化合物开发及其用于细胞自噬显微成像的研究

Autophagy and its regulators is a hotspot of research. Autophagy plays vital function in immune, infection, tumor, cardiovascular, and neural degenerative diseases. The deepening of the research is increasingly press for efficient, specific and rapid detection method of autophagy. This project targets the autophagy related protein C-CBL, by using the theoretical molecular computing combined with the synthetic organic chemistry, spectroscopy and chemical biology methods, to obtain a series of peptide- chromophore complexes L-Pn, so as to fluorescently imaging autophagy. After completing ultraviolet absorption, excitation-emission spectrum as well as protein binding titration spectral characterization, L-Pn will be applied to autophagy microscopic imaging within living cells. In addition, the potential autophagy regulating molecules screening and dynamic observation of autophagy in somatic cells will be performed.

细胞自噬及其调节分子是当前研究的热点。细胞自噬在机体免疫、感染、肿瘤、心血管以及神经退行性病变中起着重要作用。而研究的深入对高效，特异，快速的自噬检测技术提出了迫切的需求。本项目以自噬相关蛋白C-CBL为靶标，运用分子理论计算结合有机化学合成，光谱学和化学生物学方法得到系列荧光标记多肽化合物 L-Pn，从而开发细胞自噬的小分子荧光成像技术。在进行紫外-可见吸收光谱和激发-发射光谱，蛋白结合滴定光谱等表征后，将其运用到活细胞自噬体的显微成像，并开展潜在的自噬调节分子筛选以及自噬体细胞内动态观察的研究。

当前细胞自噬的研究亟需多种检测技术的支持，尤其在活细胞成像中需要可以被细胞快速吸收，毒性低，又能直接指示自噬泡存在的荧光化合物。这样在实验中可以克服目前细胞自噬实验中存在的操作复杂、耗时，不便于在活细胞中应用等问题，且能区分不同类型的细胞自噬。本项目按照项目计划书顺利执行。设计合成了基于三嗪和N,N-二乙基苯胺的有机荧光发光基团，并连接含有YFMVF的多肽，得到三款荧光探针，在多种类型细胞中如HeLa，UMC-11，NCI-H292，PANC-1等实现细胞自噬和溶酶体的活细胞成像及其动态变化。配合活细胞成像，顺利追踪细胞内荧光颗粒的亚细胞分布，直径，运动轨迹，速度并对细胞内溶酶体等进行三维成像。这三款荧光分子发光稳定（发射光位于485nm-550nm），不易淬灭，细胞毒性和光毒性都很低（在生理活性浓度下完全没有细胞毒性），可以满足长时间活细胞内的溶酶体动态观察。上述三款荧光分子能较特异地识别一类有大量成熟溶酶体聚积的细胞，说明荧光探针具有较好的细胞识别特异性。鉴于后续研究的需要，本项目后期又设计合成了两款新的荧光分子，设计上是在原有荧光分子的侧链作了一些改变，正在用于细胞内多靶标的鉴定，荧光发光变化等的研究。