TRPV4在颌下腺水分泌中的作用及机制研究

乙酰胆碱激活M受体和去甲肾上腺素激活肾上腺素受体是调控颌下腺分泌的经典途径。申请者在前期工作中首次发现颌下腺广泛分布有TRPV4受体，提示可能存在TRPV4调控颌下腺分泌的新途径，但TRPV4激活后的作用机制还需进一步研究。本课题拟采用生理学、药理学和分子生物学等方法，以大鼠和小鼠颌下腺为对象，以细胞内钙离子，微管蛋白及水通道蛋白5为靶点，探讨激活TRPV4增加颌下腺细胞内钙离子的途径；探讨激活TRPV4对微管蛋白聚敷胺化的影响；探讨激活TRPV4对水通道蛋白5功能的影响，以及相应的信号转导通路，从而明确激活TRPV4促进颌下腺细胞水和电解质分泌的分子机制，丰富和完善TRPV4调节颌下腺分泌的理论。该研究不仅为全面认识调控颌下腺分泌的机制提供新见解，而且为人工干预颌下腺的分泌提供新靶点。

背景：静息唾液主要由下颌下腺分泌，腺泡细胞内持续的Ca2+增加是保证分泌的重要信号，通过调控细胞内的Ca2+信号可以对腺体的分泌进行人工调控。目前的研究关于腺泡细胞膜上介导Ca2+进入的通道尚不清楚。实验室前期研究发现配体门控非选择阳离子通道TRPV4（transient receptor potential vanilloid subtype 4）家族成员在下颌下腺表达，但其在下颌下腺的生理功能尚不清楚。本研究旨在探讨TRPV4在下颌下腺分泌调控中的作用及其对M3R介导的唾液分泌的影响。方法：选取8～12周C57BL/6小鼠，离体小鼠下颌下腺灌流研究TRPV4激活后对分泌的影响，以及TRPV4抑制后对卡巴胆碱所诱导分泌的影响；Fura-2AM法测定TRPV4激活及抑制后细胞内钙信号变化；在体唾液收集观察TRPV4激活及抑制后对匹罗卡品诱导腺体分泌的影响。SMG-C6细胞转染trpv4的质粒，免疫共沉淀检测MAChR激动剂卡巴胆碱（carbachol，CCh）对TRPV4磷酸化的影响；SMG-C6细胞转染aqp5质粒，免疫荧光研究TRPV4激活及抑制后水通道蛋白5（aquaporin 5, AQP5）在细胞内的位置变化。结果：离体灌流结果显示，TRPV4抑制剂RN1734和HC067047会抑制卡巴胆碱所诱导的腺体分泌。在腺泡细胞上，TRPV4抑制剂也可以明显地抑制卡巴胆碱所诱导的细胞内钙离子[Ca2+]i升高。TRPV4抑制剂均可以抑制匹罗卡品诱导的腺体分泌及AQP5从细胞浆向细胞膜的转位。结论：TRPV4在M3R介导的唾液分泌中不可或缺，其发挥作用的方式是通过介导细胞外钙离子进入细胞内，影响细胞内的钙信号及下游AQP5细胞内定位。