靶向干预糖酵解重置免疫细胞糖代谢模式治疗重症肌无力的实验研究

Based on the findings that the gycometabolism of mature dendritic cells , Th1 cells and Th17 cells is different from that of immature dendritic cells and Treg cells, the present study aims to modulate glycometabolism of DCs and autoreactive T cells by employing glycolysis inhibitor, or downregulating the expression of the key enzyme of glycolysis(hexokinase) and the key regulators of the glycometabolism pathway (mTOR and HIF-1α) by siRNA. It will also evaluate the impact of glycometabolism interference on mature DCs and effector T cells on molecular, pathological and clinical levels. Furthermore, it will compare the therapeautic effects of target intference of these three key molecules of glycolysis in order to provide experimental support for translational study on the treatment of myathenia gravis by glycolysis manipulation and immune cell glycometabolism reset.

本研究基于成熟树突状细胞（mDC）与Th1、Th17细胞的糖代谢模式有别于未成熟DC和Treg细胞的研究发现，利用糖酵解抑制剂或siRNA干预DC及自身反应性T细胞糖酵解途径限速酶HK及糖酵解调控通路关键分子mTOR和HIF-1α，在体内外调控MG/EAMG免疫细胞的糖代谢模式，并从免疫分子、免疫病理到临床相关抗体多个水平进行检测，观察干预糖代谢模式对MG/EAMG中成熟DC和效应性T细胞的影响，深入探讨其机制。进一步对干预三个靶点治疗EAMG的疗效进行比较，为靶向干预糖酵解、重置免疫细胞糖代谢模式治疗重症肌无力这一治疗策略从应用基础研究到临床应用的跨越提供实验支持。

重症肌无力是常见的神经系统自身免疫性疾病, 涉及多种免疫细胞。而PI3K/Akt/mTOR-HIF-1α通路是DCs、T细胞及B细胞活化或分化过程中代谢状态调控的共同通路。我们收集MG初治患者外周血，分选得到CD19+B 细胞，DCs，CD8+T 细胞，Tregs，CD4+CD25-T 细胞，Th1, Th2 和 Th17 细胞。检测上述8种免疫细胞的糖酵解关键酶以及代谢调控通路关键分子的mRNA表达。检测上述8种免疫细胞的OCR及ECAR。同时，进一步收集来源于同一个MG患者的上述8种免疫细胞，并比较它们的糖酵解水平。并收集MG患者外周血B细胞，使用雷帕霉素及PX-478进行体外细胞干预实验。成功构建C57BL6 EAMG小鼠模型，以验证在MG患者得到的研究结果，及体外培养小鼠B220+细胞和骨髓源性树突状细胞进行机制研究。结果发现：1. 与对照组相比，除了PBMCs，Th2 和 CD8+T 细胞，MG患者外周血中B 细胞，DCs，Tregs，CD4+CD25-T 细胞，Th1 和 Th17 细胞的糖酵解关键酶和HIF-1α mRNA表达水平显著升高。同时ECAR和OCR的检测验证了上述细胞的代谢状态。比较来源于同一个MG患者的上述8种免疫细胞的糖酵解水平，与CD8+T细胞以及CD4+T细胞的不同亚群细胞相比，B细胞和DCs 细胞有着更高的糖酵解水平及糖酵解存储能力。2. 在MG患者外周血B细胞体外实验中，与未处理组相比，雷帕霉素和PX-478能显著地抑制B细胞的活化，降低胞内糖酵解水平，抑制胞内糖酵解关键酶的基因表达，但培养上清液中IgG水平无明显改变。3. 成功构建C57BL6 EAMG小鼠模型。4. 在抗原刺激下，小鼠B220+细胞及BMDC细胞表面活化标志上调，且胞内糖酵解关键酶及HIF-1α的mRNA表达上调。在PX-478的干预下，B220+细胞及BMDC细胞中HIF-1α及糖代谢关键酶表达下调，细胞活化受抑制。结论：1. 重症肌无力患者外周血中不同类型免疫细胞有不同的糖代谢模式。mTOR/HIF-1α可能是MG中B细胞糖代谢重组的关键调控靶点。 2. 成功构建C57BL/6 EAMG小鼠模型。EAMG小鼠淋巴结中不同类型免疫细胞亦有不同的糖代谢模式。3. HIF-1α在小鼠B细胞和DCs糖酵解依赖的活化中起着重要作用，可能是EAMG的治疗靶点。