基于转运蛋白和在体采样-多维液质联用技术的药对配伍规律的方法学研究

中药药对配伍规律的研究尚缺乏点面结合较系统的方法学，阻碍了中药配伍研究取得突破性进展。本课题以经典镇痛验方元胡白芷药对为研究对象，从药物转运蛋白的角度切入，采用大鼠在体微透析-多维液质联用技术，研究该药对物质基础及其相关成分对肠道转运蛋白的调控，寻找转运蛋白的可能底物；应用脑部微透析和体外脑微血管内皮细胞模型，研究该药对配伍对血脑屏障转运蛋白的作用，以及在脑部的分布和药代动力学特征，探讨该药对在透过BBB时的协同配伍作用，揭示其跨血脑屏障的转运和脑部代谢规律；通过本项目的研究，构建基于转运蛋白和在体采样-多维液质联用技术的方法学，并能应用于类似中药药对（复方）的配伍规律研究，为现代方剂配伍提供方法借鉴和科学依据。

中药配伍规律的研究是中药现代化的关键环节。目前的研究多数是围绕单个方剂，没有相对系统的方法学体系，可借鉴性较弱。本项目以元胡白芷药对作为研究对象，利用UPLC-Q-TOF-MS/MS联用技术筛选含药血浆和脑匀浆样品的镇痛活性成分，最终鉴定出入血的主要原型成分有22种，入脑的原型成分主要有14种。从单体、单味药材、药对配伍三个层面，采用大鼠在体单向肠灌流和体外Caco-2细胞转运两种模型，并结合转运蛋白，研究元胡白芷药对的肠道吸收转运机制及配伍影响。建立了大鼠肠灌流样品中元胡白芷药对11个主要成分的LC-MS/MS定量分析方法，结果发现元胡8个生物碱在十二指肠均有较好的吸收，白芷香豆素成分在三个肠段的吸收无显著性差异。元胡白芷配伍后，BBR、PTP、ACP、JAR的表观渗透系数Papp显著增加，从吸收角度证明两药配伍的合理性。加入转运蛋白P-gp的抑制剂维拉帕米后，BBR 、PTP 、JAR 、BGP的Papp均显著提高, 表明可能是P-gp的底物。加入MRP2抑制剂丙磺舒后，8个生物碱成分的Papp显著升高，白芷3个成分并无显著性变化，表明生物碱的转运可能涉及MRP2的外排作用。以非靶标性代谢组学方法，研究该药对对大鼠的止痛机制以及在血液及脑相应部位引起的内源性物质变化，结果发现福尔马林致痛模型主要的潜在生物标志物有16种，元胡主要是对氨基酸代谢及核苷酸代谢进行调节发挥镇痛作用，而白芷主要是调节磷脂代谢，药对则是元胡和白芷调节通路的综合结果；同时采用HPLC-MS/MS联用技术对在药对及相应单味药作用下的神经递质进行代谢物靶标分析，结果表明元胡、白芷的配伍使用在DA、NE、5-HT及其代谢物水平上则显示出增效减毒作用，首次从系统生物学的角度揭示元胡白芷药对配伍机制。建立了清醒SD大鼠脑在体微透析采样模型，采用HPLC-MS/MS联用方法，同时获取外源性药物成分与内源性神经递质在药对或其相应单味药作用下的动态信息，结果表明药对组中的9种单体药动学行为较之其相应单味药具有明显变化，两药伍用后能有效降低纹状体中Glu的含量和增加5-HT的含量，表明具有协同增效与减毒作用。本项目结合多种技术，从药动药效的角度对元胡白芷药对的配伍规律进行了定量研究，构建了基于转运蛋白和在体采样-多维液质联用技术的方法学体系，可应用于其他中药药对的配伍规律研究。