基于磁珠与液质联用技术的青娥方雌激素样作用物质基础研究

To clarify the effective material basis for Chinese herbal formula, the study will be performed by choosing Qing’E forluma as a model on the basis of the scientific hypothesis that the effective material basis of Chinese herbal formula in clinical use consists of the active compounds with the good pharmacokinetic properties and exposure in vivo. By integrating the technology of receptors bonded magnetic beads, evaluation of estrogenic activity, the molecular mechanism of estrogenic receptor selectivity, and UPLC-MS, a screening method of estrogenic activity will be established to study the effective material basis of Qing’E formula. By integrating the technology of serum pharmacochemistry, preparation of metabolite, and high-throughput screening of the estrogenic activity compounds, the pharmacodynamic basis for treatment of menopausal syndrome will be uncovered for Qing’E formula in the study of chemcical basis of Qing’E formula in vitro and in vivo, and estrogenic activity compounds. It will provide a new research perspective for pharmacodynamic studies. It will also offer theoretical basis and technical support for further thorough research and development of modern preparation of Qing’E forluma.

针对中药复方药效物质基础研究中存在的问题，围绕“体内有一定暴露水平且具有良好药代属性的活性化合物群是中药复方发挥临床疗效的物质基础”的科学假说，以经典名方青娥方为研究对象，整合受体键合磁珠、雌激素活性评价、雌激素受体选择性分子机制研究、液质联用技术等，建立基于磁珠与液质联用技术的雌激素活性筛选方法，开展青娥方雌激素样作用的物质基础研究。项目综合运用血清药物化学、代谢产物富集制备技术、雌激素活性高通量评价等技术，从青娥方化学成分群、体内化学成分群、具有雌激素活性的体内成分三个层次上，通过整合分析多方面化学与生物效应数据，辨析青娥方在大鼠体内的药效物质，从而阐明青娥方治疗更年期综合征的药效物质基础，为中药药效物质基础研究提供一种新的研究方法，也为青娥方现代制剂的深入开发提供一定的理论依据和技术支持。

针对中药复方复杂体系药效物质基础研究中存在的问题，以经典名方青娥方为研究对象，整合血清药物化学、亲和质谱、雌激素样活性高通量筛选技术以及雌激素样作用活性评价方法，从青娥方体外化学成分群、体内化学成分群以及主要成分的雌激素样活性研究三个层次，辨析青娥方雌激素样作用的物质基础研究。. 采用HPLC-IT-TOF/MS技术系统研究青娥方的体外化学成分群和大鼠体内化学成分群，结合化合物的准分子离子、二级碎片的精确质量数信息，从青娥方提取物中共检测并鉴定了27个化学成分，主要包括黄酮、香豆素、环烯醚萜、苯丙素及其它成分，并进一步采用标准品比对的方法确证结构；从大鼠血清样品中检测并鉴定了8个入血原型成分。基于亲和质谱技术构建了从青娥方提取物中快速发现潜在的雌激素受体配体化合物的方法，从青娥方提取物中共筛选出9种hERα-LBD的潜在的配体化合物，分别为Bakuisoflavone、Bakuchalcone、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂定、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚、Corylifol A和补骨脂酚；筛选出7种hERβ-LBD的潜在的配体化合物，分别为新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂定、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚、Corylifol A和补骨脂酚。通过Thermal Shift高通量筛选和表面等离子共振检测方法，进一步从中筛选出了与雌激素受体蛋白结合最优的三个候选化合物—补骨脂定、补骨脂酚和新补骨脂异黄酮。最后通过E-SCREEN实验发现补骨脂定、新补骨脂异黄酮和补骨脂酚均能促进MCF-7细胞的增殖活性，且拮抗剂ICI 182,780能够阻断其增殖效应，说明它们具有雌激素样活性并通过ER促进MCF-7细胞的增殖。. 本项目建立的方法可以快速的从中药复方中筛选潜在的植物雌激素，并可将此方法推广到与靶蛋白结合发挥作用的活性化合物的快速筛选，为中药药效物质基础研究提供了一种新思路。本项目的研究不仅对于阐明经典名方青娥方的药效物质基础具有重要意义，同时也为青娥方现代制剂的深入开发提供了一定的科学依据和技术支持。