观赏植物花瓣和叶片的花色素苷降解机理研究

花色素苷含量决定观赏植物叶色和花色的鲜艳程度，含量高低与其合成和降解速度密切相关。国内外对观赏植物花色素苷生物合成进行了详尽研究，但对其降解机理的研究极少。本项目拟在广泛收集具有明显花色素苷褪色现象的观赏植物的基础上，与无明显褪色的相比较，分析褪色过程中花色素苷含量、花色素苷降解酶（PPO、POD、漆酶及花色素苷-β-糖苷酶）活性的变化规律，建立和完善观赏植物花色素苷降解的PPO/POD-酚-花色素苷或漆酶-花色素苷降解模式，并克隆花色素苷降解酶基因，探讨基因表达模式与花色素苷降解的关系，以评价这些酶与花色素苷降解的相关性；重点纯化观赏植物花色素苷-β-糖苷酶蛋白并进行序列测定，研究其酶学性质，把该基因在E.Coli或酵母中表达，得到重组酶并明确其花色素苷降解功能。本项目研究结果，对于深入了解植物花色素苷的降解机理和探讨观赏植物颜色调控措施均具有重要的理论和实践意义。

本项目收集了多种具有褪色现象的观赏植物如荔枝和龙眼、四季桂，鸳鸯茉莉、夹竹桃、大叶紫薇花瓣等，以无明显褪色的红背桂、玫瑰和康乃馨等为材料，详细比较了褪色过程中观赏植物花、叶、果的花色素苷含量变化、花色素苷降解相关酶活性变化。与红背桂叶片对比，荔枝、龙眼、四季桂叶片从幼叶至成熟叶过程中，花色素苷含量逐渐降低，鸳鸯茉莉、夹竹桃、大叶紫薇花瓣在发育和衰老过程中花色素苷含量也不断降低，这些材料均能检测到高活力的PPO或POD活力或花色素苷降解酶活力，表明这些酶可能参与了花色素苷酶促降解。以部分纯化花色素苷为底物，在荔枝中检测到一种高活力花色素苷降解酶，随后对其进行了分离纯化，从SDS－PAGE胶上切取目的蛋白带，质谱鉴定各片段均为漆酶（Laccase）片段。根据蛋白质片段克隆到荔枝LAC基因的全长cDNA序列，漆酶基因在果皮中的表达比PPO高1000倍以上。通过对不同底物VMAX/ KM比较，发现外源表儿茶素是该酶的最适底物，利用LH-20柱层析分离到漆酶底物，经HPLC AND MS/MS鉴定其为表儿茶素，而在荔枝果皮花色素苷降解和果皮褐变过程中，果皮表儿茶素逐渐降低。与叶片、茎、根等组织相比，漆酶基因和漆酶蛋白均在果皮中表达最高，免疫金和LAC::EGFP洋葱表皮细胞定位表明，漆酶定位在液泡、内质网，这与它的功能是一致的。此外，还在鸳鸯茉莉和夹竹桃花瓣中发现高活力的β-糖苷酶，通过硫酸铵分级盐析、DEAE Sepharose 和Sephadex G 200柱层析后，在鸳鸯茉莉花瓣中获得了回收率为1.96％、纯化倍数为40.93的β-糖苷酶，在夹竹桃花瓣中获得了回收率为10.99％、纯化倍数为15.51的β-糖苷酶，经进一步检验达到电泳纯，获得单一条带。利用纯化的β-糖苷酶，最两种酶的酶学性质和底物专一性进行了研究。两种来源的β-糖苷酶但对底物的专一性差异很大，从SDS－PAGE胶上切取目的蛋白带，质谱鉴定结果表明，来自鸳鸯茉莉花瓣中的酶可能是β-D-xylosidase，来自夹竹桃花瓣中的酶可能是类似β-glucosidase的酶。鸳鸯茉莉花瓣的β-糖苷酶能使反应体系中的花色素苷吸收峰降低，而出现另外一个新的吸收峰，可能具有比较明显的花色素苷降解活力，但夹竹桃花瓣β-糖苷酶则没有发现花色素苷降解活力。