肿瘤相关巨噬细胞在卵巢癌肿瘤异质性中的作用及相关机制研究

Our research mainly focuses on the functions and mechanisms of tumor associated macrophage (TAM) in tumor heterogeneity in ovarian cancer. First, we use immunohistochemical and flow cytometric methods to detect the phenotype of TAM in different specimen from the same patients with advanced ovarian cancer. Additionally, flow cytometric method will be adopted to detect the phenotype change of macrophages after co-culture with highly aggressive and less aggressive subclonings of ovarian cancer cells, to prove the existence of phenotype heterogeneity of TAM in the microenvironment of ovarian cancer. Second, to explore the functions of TAM in ovarian cancer development, we will compare the changes in biological behaviors of ovarian cancer cells after co-culture with supernatant of TAM, mainly through in vivo and in vitro experiment. Third, we will detect the changes in cytokines and miRNAs of TAM after co-culture with supernatant of ovarian cancer cells, to explore the possible mechanisms of TAM in tumor heterogeneity in ovarian cancer to provide potential targets for treatment.

本课题主要研究肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在卵巢癌肿瘤异质性中的作用及相关调控机制。首先，采用免疫组化方法和流式细胞学方法，在组织芯片和新鲜组织标本中进检测TAM在不同部位的表型。将来自同一卵巢癌细胞母系的侵袭能力不同的单克隆亚系与人原代巨噬细胞共培养，采用流式细胞学方法，检测不同侵袭能力的卵巢癌细胞上清对TAM表型的诱导作用，证明卵巢癌微环境中TAM存在表型异质性。其次，为了明确TAM在卵巢癌发生发展过程中的作用，我们将卵巢癌细胞与人原代巨噬细胞共培养，诱导TAM表型改变，用所收集的上清液处理卵巢癌细胞，比较处理前后卵巢癌细胞生物学功能的改变。再次，为了了解TAM在卵巢癌肿瘤异质性中的作用机制，我们收集卵巢癌细胞的培养上清液，将上清液与人原代巨噬细胞共培养，诱导TAM表型改变，利用细胞因子抗体芯片和miRNA芯片，筛选处理前后表达具有差异性的蛋白分子和miRNA分子，并进行生物信息学分析。

本研究旨在明确肿瘤相关巨噬细胞及其分泌的外泌体(exosome)在卵巢癌肿瘤异质性中的作用及相关机制。首先，将单核巨噬细胞与人卵巢癌细胞非接触式共培养，检测肿瘤相关巨噬细胞标志性分子CD206的表达。其次，将肿瘤相关巨噬细胞与人卵巢癌细胞共培养，研究其对卵巢癌生物学行为的影响。再次，超速离心法提取巨噬细胞分泌的exosomes，将巨噬细胞分泌的exosomes加入到卵巢癌细胞中，检测其对卵巢癌生物学行为的影响。最后，提取exosomes的总RNA，构建miRNA文库，比较不同巨噬细胞exosomes携带的miRNA有无差异。将巨噬细胞的exosomes加入到卵巢癌细胞中，提取总RNA，构建mRNA文库，比较不同巨噬细胞exosomes加入前后卵巢癌细胞mRNA的差异，探讨巨噬细胞exosomes对卵巢癌细胞作用的分子机制。经研究发现，巨噬细胞与卵巢癌细胞共培养后向M2型极化，形成肿瘤相关巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞可以通过分泌的exosomes促进卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭、耐药能力。肿瘤相关巨噬细胞分泌的exosomes与M0巨噬细胞分泌的exosomes所携带的miRNA不同，下调的miRNA有hsa-miR-21-3p和hsa-mir-7851-p5，上调的miRNA有hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-148b-3p和hsa-miR-210-3p。肿瘤相关巨噬细胞通过exosomes向人卵巢癌细胞传递miRNA及其他分子，进而改变人卵巢癌细胞的转录组，并可能通过MAPK、focal adhesion等信号转导通路改变卵巢癌细胞的生物学行为如细胞周期、细胞外基质构成等。