SbALKBH1A介导DNA 6mA影响高粱胚性愈伤再生能力的机制研究

Sorghum bicolor is an important cereal crop. Low callus regeneration ability of sorghum limits establishment of an efficient genetic transformation system. This is the bottleneck of fundamental research and genetic improvement in sorghum. We obtained two types of embryonic callus with different regeneration capacity from immature embryo in sorghum cultivar Sb19. N6-methyladenine (6mA) was significantly different in these two types of embryonic callus, and DNA adenine demethylase SbALKBH1A is highly expressed in the callus with higher regeneration capacity. My published data showed that 6mA, mediated by OsALKBH1, played an important role in rice development. Similarly, we assumed that 6mA mediated by SbALKBH1A may affect regeneration capacity of sorghum embryonic callus, but the mechanism is not clear. This project intends to apply 6mA-IP-seq and RNA-seq during sorghum callus regeneration to study gene expression profile regulated by 6mA; Then, SbALKBH1A mutant and transgenic plants are obtained to screen candidated genes and related pathway by using high-throughput sequencing techniques in callus tissues. Further analysis will be applied to identify mechanism of 6mA, mediated by SbALKBH1A, in affecting regeneration capacity of sorghum embryonic callus. Thus, this project will provide genetic resources and theoretical guidance for establishment of an efficient regeneration system.

高粱是重要的谷类作物。愈伤再生能力低下限制了高粱高效遗传转化体系的建立，这成为高粱基础研究和遗传改良的瓶颈。申请人以高粱品种Sb19幼胚为材料，获得再生能力不同的两种胚性愈伤，发现N6-甲基腺嘌呤（6mA）在两种胚性愈伤中存在显著差异，且DNA去腺嘌呤甲基化酶基因SbALKBH1A在再生能力较强的胚性愈伤中高表达。申请人已发表结果表明OsALKBH1介导6mA在水稻生长发育中具有重要作用。据此推测SbALKBH1A可能介导6mA影响高粱胚性愈伤的再生能力，但其作用机制并不清楚。本项目拟利用6mA-IP-seq和RNA-seq等技术研究6mA在高粱胚性愈伤再生过程中的基因表达调控规律；构建SbALKBH1A突变体和转基因材料，对其愈伤组织采用高通量测序技术筛选候选基因并分析相关通路，以解析SbALKBH1A介导6mA影响胚性愈伤再生能力的机制，为建立高粱高效再生体系提供基因资源和理论基础。

高粱是重要的谷类作物之一。愈伤再生能力低下限制了高粱高效遗传转化体系的建立，这成为基础研究和遗传改良的瓶颈。本项目主要完成以下四个方面的研究内容：（1）以三种不同再生能力的高粱愈伤为研究对象，绘制了全基因组转录图谱。结果表明：植物核糖体、木质素代谢以及糖类代谢可能参与了高粱愈伤再生过程。（2）揭示全基因组范围内组蛋白甲基化（H3K4、H3K27和H3K36的二甲基化和三甲基化）对mRNA和lncRNA基因的表达调控规律。H3K4me3和H3K36me3的协同修饰在mRNA基因活跃表达的背景下与lincRNA的产生负相关。（3）解析高粱基因组上可及染色质区（ACR）图谱以及其调控基因表达规律。本项目鉴定到高粱全基因组21077个ACRs，并比对到22.9%的基因和2.7%的重复序列。在转录起始位点附近ACR存在一个窄而尖的信号峰，而整个基因区上的信号则相对弱而宽；从转录终止位点到其下游区域有一个明显而宽的峰。另外，基因表达水平和ACRs分布密度之间的相关性依赖于ACRs位置，并且基因区ACR的累积会增强基因间ACR关联基因转录活性。（4）解析高粱基因组中6mA修饰图谱，并初步研究腺嘌呤甲基转移酶和去甲基化酶基因在愈伤再生过程中的作用。本项目发现6mA的分布以及调控基因表达方面存在保守性。基因区间的6mA与基因活跃表达相关，而且基因区的ACR可能参与这个过程。本项目对10个SbALKBH腺嘌呤去甲基化酶，6个SbMTA等在内的甲基转移酶进行克隆、酶活等实验，并利用酵母双杂交实验确定SbMTA等互作蛋白。本项目在不同再生能力的愈伤中获得SbALKBH1等基因的遗传转化材料，转化结果表明SbALKBH1等基因可能影响愈伤再生过程。这些研究结果为高粱高效再生和遗传转化体系的建立提供基因资源和理论基础。