单个活细胞内蛋白激酶时空信息获取新方法及应用

Protein kinases catalyze the transfer of the phosphate group of ATP onto serine, threonine or tyrosine residues of substrate proteins. Protein phosphorylation plays a critical role in cell-cycle progression, transcription cycle and cell apoptosis, which are closely associated with various human diseases, such as cancer. So far, the shortage of in vitro and in vivo methods for determination of protein kinases in living cells limits the study on protein kinases and development of some drugs. In this proposal, we want to develop a tempo-spatially resolved method for determination of protein kinases in single living cells by combination of fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and microfluidic chip. Based on the structure of protein kinase inhibitors, new fluorescent probes are synthesized to covalently label protein kinases in living cell. Microfluidic chips are used to in situ cell culture, and FCS is used to obtain the tempo-spatial information of protein kinase in living cell. In this study cyclin dependent kinase 7 （ CDK7） is used as a study model, a new method is established to obtain tempo-spatial information of protein kinases in living cells. We will systematically investigate the effects of biomolecules, drugs and micro-environments on protein kinase in living cells. .

蛋白激酶是一类催化蛋白质磷酸化反应酶，它在细胞周期调控、控转录调控及细胞凋亡等多种生物学过程中发挥十分重要的作用，与某些重大疾病（如癌症）的发生、发展密切相关。目前，由于缺乏活细胞内蛋白激酶的原位分析方法，严重地影响了蛋白激酶研究进展和临床药物的开发。该项目旨在以微流控芯片为在线细胞培养和操作系统，单分子荧光相关光谱为检测单元，构建一种单个活细胞内蛋白激酶时空信息获取新方法。基于蛋白激酶抑制的分子结构信息，设计合成新型荧光标记探针，实现活细胞内蛋白激酶高选择性共价标记。基于荧光探针和荧光标记蛋白激酶分子量的差异，通过对荧光相关光谱二元非线性拟合获取细胞内游离探针和荧光标记蛋白激酶浓度的时空信息。以细胞周期蛋白依赖激酶（CDK7）为模型，系统地研究某些生物分子、药物分子和微环境对蛋白激酶活性影响，获取单个活细胞内蛋白激酶时空信息，为蛋白激酶基础和癌症病理研究及药物的筛选提供新方法。

蛋白激酶是一类催化蛋白质磷酸化反应酶，它在细胞周期调控、控转录调控及细胞凋亡等多种生物学过程中发挥十分重要的作用，与某些重大疾病（如癌症）的发生、发展密切相关。目前，由于缺乏活细胞内蛋白激酶的原位分析方法，严重地影响了蛋白激酶研究进展和临床药物的开发。本项目将微流控芯片与单分子荧光相关光谱结合，构建了一种单个活细胞内蛋白激酶时空信息获取新方法。研究成果如下：1.构建了微流控芯片-单分子荧光相关光谱联用系统，用于单个活细胞内蛋白激酶活性、蛋白质磷酸化研究。2. 基于蛋白激酶抑制的分子结构信息，设计合成新型荧光标记探针，实现活细胞内蛋白激酶高选择性共价标记。基于荧光探针和荧光标记蛋白激酶分子量的差异，通过对荧光相关光谱二元非线性拟合获取细胞内游离探针和荧光标记蛋白激酶浓度的时空信息。以RSK2激酶为模型，建立了RSK2激酶活性测定方法。系统地研究某些生物分子、药物分子和微环境对RSK2性影响，获取单个活细胞内蛋白激酶时空信息。2. 合成ATP模拟物，结合FCS和荧光成像技术，建立了活细胞内蛋白质磷酸化分析新方法。我们的研究工作将为蛋白激酶基础、癌症病理研究及药物的筛选提供新方法。