时空分辨波动光谱光学系统研究及样机研制

In this project, we want to develop the temporally and spatially resolved single molecule fluctuation spectroscopy (fluorescence correlation spectroscopy and light scattering correlation spectroscopy) using light sheet illumination mode, orthogonal optical configuration and electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) as an array detector. Its principle is based on high throughput measuring the fluctuations of fluorescence or resonance scattering light in a small volume due to Brownian motion of single molecule or single nanoparticles such as quantum dots or gold nanoparticles. The thin light sheet mode is developed using a new optical configuration and high number aperture objective. The optical configuration and optical elements are optimized, and the effects of certain factors such as the thinness of laser light sheet, intensity and wavelength are investigated. The theoretical model of spatially resolved single molecule fluctuation spectroscopy is established in light sheet illumination mode according to molecular diffusion dynamics of and correlation analysis. The relation of the correlation function between the numbers of molecules and the characteristic diffusion coefficient are established. The software for the high through-put data processing is developed. The key techniques are obtained about the fabrication of the spatially resolved single molecule fluctuation spectroscopy. The prototype instrument of spatially resolved single molecule fluctuation spectroscopy is fabricated according to the experimental results obtained. The spatially resolved single molecule fluctuation spectroscopy will be used for study on heterogeneous systems, such as, the motion of proteins on cell membrane and plasma.

细胞是一种非均相动态体系，不同空间时间物质的组成和功能处于变化之中。传统的方法和仪器很难获得细胞内时空间信息。本项目旨在设计新型激光光片照射模式，采用正交光学构型和高灵敏电子倍增电感耦合器件（EMCCD）为面阵检测器，构建时空分辨波动光谱探测平台，原位获取细胞时空信息。系统地研究光学构型，激光照射参数对探测系统的影响，系统优化元件的配置，减少激光照射厚度和散射光影响，提高时空分辨波动光谱的分辨率和灵敏度。基于分子的扩散运动行为和相关分析，建立在光光片照射模式下，时空分辨波动光谱理论模型。发展高通量数据处理方法和软件。获得时空分辨波动光谱的关键技术和实验方法。研制一台拥有自主知识产权高灵敏时空分辨波动光谱样机。建立细胞时空信息获取新方法，用于原位细胞研究。这种新的方法和仪器不同于目前商品化仪器，能够原位获得细胞时空信息，将对细胞生物学、重大疾病如癌症的病理研究和临床诊断具有十分重要的作用。

细胞是生命的基本单元。细胞是一个非均相体系，不同空间内生物分子的浓度和活性是处于动态变化之中，因此单细胞分析方法应该具有时空分辨能力。该项目构建了时空分辨波动光谱实验平台，系统地研究了光学构型、激光照射强度和光子收集模式对探测系统的影响。优化了光学构型、元件参数、激光照射参数对检测系统的影响，减少了背景散射光的影响，使光片的厚度降至1.7 微米。建立了不同光学构型下时空分辨波动光谱理论模型。计算机模拟和实验证实该模型能够于微区内纳米粒子和荧光分子扩散动力学。发展了时空分辨波动光谱数据处理方法和样品的制备方法。采用光片光学照射模式，基于正交光学构型，以高灵敏的电子倍增电感耦合器件（EMCCD）为检测器，研制了一台时空分辨波动光谱仪样机。成功地用于单颗粒（如荧光量子点，金纳米粒子）和荧光单分子探测，获得了其时空分辨波动光谱。将时空分辨波动光谱方法用于细胞内金纳米粒子扩散行为的研究。研究结果表明，细胞内的纳米粒子的扩散行为是受限的，说明了细胞内环境是非均匀的。时空分辨波动相关光谱，能够原位获得细胞内生物分子的时空信息，将在细胞生物学基础和某些重大疾病如癌症的病理研究发挥重要作用。.在本项目研究期间，研制一台的空分辨波动光谱仪样机，在J. Am. Chem. Soc., Anal. Chem., J . Phys. Chem.,等期刊发表SCI论文21篇，获教育部自然科学一等奖一项（活细胞时空分辨光学分析新方法研究，证书号：2016-013）。本项目全面完成了研究计划，达到了预期的目标。