单细胞内单个磷酸酶分子的生物信息检测研究

The development of accurate diagnosis of single-cell or even single-molecule biomarkers helps diseased cells to provide early treatment in the curable phase, using the big data single-cell analysis strategy to achieve accurate in-situ extraction of each individual bioinformation. Taking the biomarker alkaline phosphatase (ALP) as an example, as an important indicator for the detection of liver-related cancer diseases, it is urgent to develop a single-cell in situ single-molecule biological information extraction method. The single-molecule information research of biological nanopore based on electrochemical method utilizes the nano-space confinement effect to have ultra-high time and spatial resolution ability for single molecules. At present, single-base information recognition and extraction of single-stranded DNA has been realized. However, traditional biological nanopore approaches are limited by devices, making it difficult to achieve in situ extraction of individual biomolecule information for a single cell. This project intends to develop a single-cell based single-molecule transient time-frequency information extraction method in a single cell, innovatively combine biological nanopore and micro-manipulators, break through the traditional nanopore application limitation, and construct single-cell in situ based bio-nano The single-molecule biological information detection device of the channel, and using spectrum analysis and deep learning strategies, constructs a single-cell single-molecule interaction spectrum, and develops the extraction of individual biomolecule information for precise diagnosis and research of the disease in the curable stage.

发展单细胞甚至单分子水平生物标志物的精准诊断有助于病变细胞在可治愈阶段提供早期治疗方法,利用大数据单细胞分析策略实现对每一个生物个体信息的原位精准提取。以生物标志物碱性磷酸酶（ALP）为例，作为肝脏相关癌症疾病检测的重要指标，亟需发展单细胞原位的单分子生物信息的提取方法。基于电化学方法的生物纳米孔道单分子信息研究利用纳米空间限域效应，对单个分子具有超高时间、空间分辨能力，目前已经实现对单链DNA的单碱基信息的识别和提取。然而传统生物纳米孔道受限于装置，难以实现对单个细胞的单个生物分子信息原位提取。本项目拟发展单细胞内基于纳米孔道单分子瞬态时频信息提取方法，创新性地结合生物纳米孔道与微操装置，突破传统纳米孔道应用场景的局限性，构建单细胞原位基于生物纳米孔道的单分子生物信息检测装置，并利用频谱分析以及深度学习策略，构建单细胞单分子相互作用谱图，发展为精准诊疗与研究的单个生物分子信息的研究策略。

发展单细胞内单分子水平生物标志物的精准诊断有助于在病变细胞在可治愈阶段提供早期治疗方法。本项目为了实现单细胞内质组分分析，发展了在微米级玻璃毛细管尖端构建仿生细胞膜并自组装生物纳米孔，结合毛细管与微操作平台的兼容性以及生物纳米孔的单分子水平分辨能力，优势互补。进一步利用细胞外泌体，其具备与宿主细胞相似的细胞膜性质以及细胞内质组成，由本项目发展的外泌体与平面脂双层孵育融合技术，在平面脂双层上构建灵敏生物纳米孔道传感器，具备对外泌体内质组分进行单分子水平分析，从而映射母细胞内质组分，具备了单细胞单分子水平分析的阵列化可行性。.生物传感方面，分别构建了核酸探针分子以及多肽探针分子，基于纳米孔道单分子传感技术，发展了对生物分子空间异构体分辨能力。具体而言，核酸探针分子具有普适性以及易获得的特点，利用Aerolysin生物纳米孔，优化构建了K238Q纳米孔传感界面，通过调控纳米孔道界面探针与待测物的分子间相互作用，将检测时间分辨能力提高了2个数量级，从而实现了在混合样品中单分子水平对碱基的氧化修饰、甲基化修饰以及磺胺类修饰的定性定量分析方法，有望对碱性磷酸酶相应的特异性核酸探针分子进行精准分析。氨基酸探针分子具备体积小修饰多样化的特点，针对单个氨基酸空间异构分辨，本项目利用OmpF纳米孔具备横向非对称静电场，对丝氨酸（S）及其磷酸化（pS）以及手性异构体具备空间分辨能力，进一步证明了基于OmpF横向非对称静电场用于检测氨基酸手性异构体的普适性，有望将更小更灵敏的多肽分子作为碱性磷酸酶（ALP）在细胞内的探针分子，实现痕量定量分析细胞中的以碱性磷酸酶为例的肿瘤标志物.在课题执行期间，总结了纳米孔道单分子技术需要在高带宽、高增益的器件指标与高通量之间进行权衡，共性发展以大数据驱动的纳米孔道单分子技术，为诊断细胞内肿瘤标志物提供单分子分析手段。