高核酸背景下的DNA预扩增及检测技术

Nucleic acids amplification is the key technology widely used in medical treatment, food safety, and sanitation field. However, the existing techniques can hardly balance high sensitivity and specificity which may lead to misjudgement. Especially in actual food sample, the large amount of background nucleic acids usually lowers the sensitivity and easily to give a false-positive result, which limits its practical application. One strategy commonly used to overcome this problem at present is fluorescent quantitative PCR, also along with some disadvantages such as high cost, requiring high quality sample, and low reproducibility. By reverse thinking, take advantage of the high background, this study is aimed to solve the problem that high sensitivity and specificity cannot be easily achieved at the same time. Furthermore, by using the same principle, rolling circle amplification (RCA) will be greatly improved to achieve DNA target amplification under room temperature and satisfy the requirements of facile, low cost, and accuracy. The feature of this method is to separate the amplification to two steps. In the first step, some fragments of background nucleic acids having the same sticky ends with the target DNA fragment were ligated together with the universal adaptor. After ligation, these newly formed fragments can be served as template for pre-amplification along with the target fragment, thus the template number for pre-amplification is increased and high sensitivity is obtained. In the second step, a pair of target-specific primers is used to obtain the high specificity. For supplying basic technique, the main contents of this study include establishment of theoretical model, design of nucleotide sequences, and evaluation of detection effect.

核酸检测是医疗、食品、卫生等领域的关键技术，而实际样品检测中很难解决高灵敏度与高特异性的矛盾，易产生误判。特别是对于食品或病体组织中病菌病毒含量极低的情况，因大量背景核酸的干扰，检测灵敏度降低，假阳性频发。目前主要采用荧光定量PCR法解决检测精确度不足的问题，但对样品要求严格，结果仍不稳定。本项目将进行逆向思维，在预扩增中有效利用大量的背景核酸来提高扩增的灵敏度；然后进行特异性扩增，解决特异性和灵敏度不能共同提高的矛盾。同时，利用上述原理对滚环扩增进行根本上的改进，实现常温检测，达到简便、经济、准确等实用要求。本方法的特点是分两步进行，预扩增中利用酶切后部分背景核酸与靶DNA具有同样粘性末端的性质，使扩增灵敏度提高数百倍以上；特异性扩增中采用比较温和的条件达到高特异性。本项目将研究理论模型建立、序列设计、检测效果评价等内容，为高核酸背景下的核酸检测提供技术基础。

核酸扩增在生物工程、食品、医疗、卫生等多个领域有着广泛的应用，是生命科学及其应用领域的关键技术。而实际样品检测中很难同时提高灵敏度与特异性，往往顾此失彼，易于产生误判。虽然荧光定量PCR法可部分解决检测精确度不足的问题，但对样品要求严格，高灵敏检测的结果也不稳定。例如，在食品或病体组织中病菌病毒含量极低的情况下，因大量背景核酸的干扰，检测灵敏度降低，假阳性频发。本项目针对这一问题，采用逆向思维，提出了将特异性和灵敏度分步进行的基本理论，并将其应用于聚合酶链式扩增（PCR）和滚环扩增（RCA），同时提高了灵敏度和特异性，且大大减少了二者的相互制约；将开发的技术应用于实际样品，实证了该理论具有广泛的应用前景，易于推广使用。项目的关键成果是，通过采用IIS型限制性内切酶，使包含Target在内的很多酶切片段都含有5-9碱基长的特定序列，这样连接接头（线性或成环）后进行PCR或RCA扩增，可以提高灵敏度100-1000倍以上；这样可以大大减轻后续特异性扩增的压力，在不产生非特异性扩增的条件下进行扩增，使准确率接近100%。同时，采用RCA可在恒温条件下扩增，并直接肉眼观测扩增结果，不必使用可快速变温的PCR仪。另外，在解决DNA高效特异性连接及环化等问题中，取得了以下重要成果：1）实现了DNA的高效环化，解决了DNA环化过程中易产生多聚副产物的问题，并成功制备出了稳定的左螺旋DNA，共发表SCI论文10篇（包括IF > 10论文3篇）；2）开发了采用高分辨率熔点测定法（HRM）高通量测定短链DNA熔点的方法，并用于分析DNA二级结构和定量分析DNA连接酶的动力学特性等；3）发现了DNA模板的二级结构形成会显著影响PCR等方法的扩增效率，需要在引物设计时予以充分考虑；4）将核酸扩增技术用于大量制备DNA并用作纳米材料等。本项目共发表论文33篇（SCI论文26篇），其中以本项目为第一标注项目号的SCI论文24篇，中文论文5篇。本项目的基础理论成果和开发的技术在核酸研究领域具有非常广阔的应用前景。