绿脓杆菌致病性相关双组分系统的筛选及其作用机制研究

The two-component systems of Pseudomonas aeruginosa play an important part in sensing diverse stimuli and enable an appropriate and rapid adaptive physiological response and may allow P. aeruginosa to circumvent the cellular immune response. The genome of P. aeruginosa encodes 64 sensor kinases and 72 response regulators, however 1/3 of total TCSs’ function are unknown. We identified about 684 P. aeruginosa genes that may be involved in defense against host bacterial clearance. Furthermore, we found 17 TCSs of P. aeruginosa strain PA14 using Tnseq which may play an important role in skin infection including 4 unknown TCSs. We constructed TCSs gene PA14_46990 deletion strain, which is predicted to encode a plasmic oligonucleotide-binding domain protein and found the virulence of deletion strain significantly decreased in mice skin infection. Next we will analyze which virulence genes were regulated by TCSs gene and how TCSs regulate the host inflammatory response. Using RNAseq uncovers a previously unexplored signal transduction pathway, PA14_46990, for the regulation of virulence factor genes expression in P. aeruginosa. Our results will help to uncover unknown mechanisms of TCSs modulating various virulence factor gene expression of Pseudomonas aeruginosa and TCSs’ function of host responses against bacterial infection.

绿脓杆菌的双组分系统使得细菌可以感知细胞外的信号，从而调节细菌基因的表达，有利于细菌在伤口上的生存，提高菌株感染能力。通过对绿脓杆菌全基因组分析，发现其拥有64个双组分系统的组氨酸激酶基因和72个双组分系统的转录调节子，但其中约有1/3的双组分系统的功能未知，在宿主感染中作用更是尚未知晓。我们前期通过Tnseq技术初步筛选到17个绿脓杆菌在皮肤感染中致病性相关的双组分系统基因，其中4个双组分系统基因功能未知。我们选择双组分系统基因PA14_46990构建了基因敲除菌株，通过小鼠皮肤感染实验发现该基因敲除菌株感染能力明显下降。同时我们还将对筛选到的双组分系统基因的调控绿脓杆菌毒性因子的分子机制及对宿主的炎症反应的应答机制作进一步的研究，以揭示绿脓杆菌双组分系统在皮肤感染中的重要作用；为系统了解绿脓杆菌引起皮肤感染的机制奠定结实的理论基础，为有效医治感染病人，防止皮肤感染提供理论支持。

绿脓杆菌作为临床常见的条件性致病菌，其众多未知的双组分调节系统如何发挥功能从而促进感染的机制仍然知之甚少。本项目首先利用绿脓杆菌PA14的转座子文库高通量测序技术，筛选绿脓杆菌皮肤伤口感染过程中致病性相关的双组分调节系统基因。筛选得到显著影响皮肤伤口感染的四个未知的双组分调节系统基因，分别是PA14_32580 (nioR)、PA14_45870、PA14_49420和PA14_64570。为了研究这四个双组分调节系统促进绿脓杆菌皮肤伤口感染的分子机制，我们对这四个基因敲除菌株进行了RNA-seq分析。结果表明四个双组分系统都可以通过调节绿脓杆菌的毒力基因表达来促进绿脓杆菌皮肤伤口感染。其中，NioSR调节反硝化系统相关的基因比较显著，其中在反硝化系统中发挥重要作用的一氧化氮还原酶基因norCBD受到NioSR调节最明显。为了研究NioSR在皮肤伤口感染过程中具体的功能机制，我们对nioSR基因敲除株的表型进行了分析，结果显示NioSR可以调控鞭毛合成基因的表达来影响绿脓杆菌鞭毛介导的快速黏附能力，以影响其生物膜的形成。同时，通过测定其鞭毛依赖的群集运动能力也佐证了NioSR系统对绿脓杆菌鞭毛的影响。另一方面，我们发现NioSR可以通过调节algD基因表达来增强绿脓杆菌抵抗宿主巨噬细胞吞噬，从而有助于其皮肤感染。实验结果进一步证明，NioSR能够通过调节一氧化氮还原酶基因norCBD来降解一氧化氮，以抵抗一氧化氮杀伤，从而促进其在皮肤伤口中的感染。最后通过分析NioSR与已知的反硝化通路相关的调节子的相互作用，发现NioSR是不受已知反硝化系统调节子调控的新型反硝化调节系统。综上所述，本项目证明了绿脓杆菌的四个新型双组分调节系统通过调控下游毒力因子的表达来促进皮肤伤口感染，并进一步阐明NioSR在皮肤伤口感染中的分子机制，为解决临床皮肤伤口感染提供了新的理论基础和治疗思路。