卵内MTOR信号调控NUP50的选择性翻译进而促进减数分裂恢复的作用机制研究

Oocyte maturation failure, which is closely associated with meiotic resumption, played a crucial role in female infertility. Previously, we reported MTOR pathway could stage-specifically affect the granulosa cell fate and oocyte quality. Meanwhile, deleted Mtor specifically in growing oocyte caused the delay of oocyte meiotic resumption and down-regulated the nuclear pore complex NUP50. Thus, we assume that MTOR may promote the meiotic resumption of oocytes by selectively translating NUP50. In an effort to investigate our hypothesis, this project intends to explore：（1）the correlation between the activity of meiosis resumption key factor MPF and MTOR through confocal live imaging system; （2）the role of MTOR involved in the regulation of selective translation in NUP50 by luciferase reporter;（3）the further validation of NUP50 involved in oocyte meiotic resumption in vitro and vivo. Answering those questions will provide new theoretical basis for diagnosis of unexplained oocyte maturation disorders in clinic, as well as proof of principle for therapy improvement of in vitro oocyte culturing.

卵母细胞成熟障碍是导致女性不孕的关键原因，其产生与卵母细胞减数分裂恢复过程密切相关。前期我们报道了MTOR阶段特异地影响颗粒细胞的命运和卵母细胞的质量。其中我们发现特异性敲除生长时期卵母细胞内Mtor后，卵母细胞减数分裂恢复推迟，卵内核孔蛋白NUP50表达下调。在此我们提出科学假说：MTOR可能通过选择性翻译NUP50进而促进卵母细胞减数分裂恢复。为了验证该假说，本项目拟：（1）利用活细胞成像系统等技术探究MTOR与减数分裂恢复关键调控因子MPF活性的相关性；（2）利用荧光报告基因标记等手段明确MTOR参与调控NUP50的选择性翻译；（3）利用体内外实验进一步验证NUP50参与卵母细胞减数分裂恢复的作用。本研究将为临床上不明原因的卵母细胞成熟障碍的诊断提供新的依据，也为卵母细胞体外培养等治疗手段的改进提供线索。

在翻译水平上进行转录后调控是发育生物学中一项重要的生物学事件。前期我们报道了MTOR能阶段特异地参与卵母细胞内的选择性翻译过程，进而影响颗粒细胞的命运和卵母细胞的质量。其中我们发现特异性敲除生长时期卵母细胞内Mtor后，卵母细胞减数分裂恢复推迟，同时卵内核孔蛋白NUP50表达下调。我们提出科学假说：MTOR可能通过选择性翻译NUP50进而促进卵母细胞减数分裂恢复。为了验证该假说，我们利用体外实验进一步验证NUP50的敲降能使卵母细胞减数分裂进程推迟，同时纺锤体组装及染色体排列受到明显影响。在该课题的更进一步的深入研究中, 我们发现了真核翻译起始因子eIF4E1B参与调控哺乳动物母源mRNA选择性翻译的关键环节，其功能缺失后影响卵母细向胚胎转换过程中包括NUP50在内的多个关键功能蛋白翻译，最终使得受精后的卵母细胞停滞在二细胞阶段。.利用LACE-seq技术我们明确了eIF4E1B所结合的靶标mRNA，通过进一步分析发现其倾向性结合在靶标mRNA的5’UTR区域的CCGCC序列，这提示我们mRNA的非编码区存在特定的调控元件，这些元件可能调控卵母细胞内mRNA的选择性翻译激活。此外，我们进一步通过蛋白质谱验证了eIF4E1B靶向结合的mRNA在蛋白水平的变化并利用免疫共沉淀-蛋白质谱鉴定并验证了与eIF4E1B相互作用参与翻译起始过程的蛋白互作网络，最后，我们预测了eIF4E1B参与卵母细胞向胚胎转换过程中母源mRNA被选择性翻译的“闭环”模型：翻译起始因子协同3′UTR结合蛋白选择性募集5′UTR富含CCGCC序列的mRNA，激活其在卵母细胞向胚胎转换过程中的翻译，以参与卵子发生，卵母细胞成熟，受精及早期胚胎发育等关键事件。这一重要工作为将来挖掘参与哺乳动物卵母细胞向胚胎转换过程中的关键蛋白提供了参考，同时也将为研究人类卵母细胞向胚胎转换过程中的母源mRNA翻译调控奠定了坚实的基础。