基于PI3K/AKT/GSK-3β信号通路调控HOC上皮间质转化探讨鳖甲煎丸防治肝癌前病变的作用机制

Early prevention and treatment of liver precancerous lesion are of significant importance for reducing incidence and mortality of liver cancer in clinical practice. Based on the good foundation of studies on Biejiajian Pills’s anti-liver fibrosis,anti-liver cirrhoisis and anti-liver cancer functions and research advancement of the close relationship between hepatic oval cell (HOC)'s epithelial-mesenchymal transition (EMT) and liver precancerous lesion, this study will take HOC’s EMT as the entry point to explore the tumorigenic mechanism of HOC’ EMT converting into malignant proliferation of liver cancer cells regulated by PI3K/AKT/GSK-3β signaling pathway. The research objects will include rat HOC models, dynamic models of rat liver precancerous lesion,and postoperative liver pathologic tissues of liver cancer patients. Methods such as plasmid tranfection, gene silencing, immunofluorescence and polymerase chain reaction will be applied in our study. To probe further into molecular mechanism of Biejiajian Pills inhibiting liver precancerous lesion whether by interfering in HOC’s EMT, small animal in vivo imaging system and immunohistochemistry will also be adopted. This study will be of great value in screening the efficacious index of diagnosis, treatment and prognosis of liver precancerous lesion and identifying novel therapeutic targets of liver cancers. What’s more, it will also contribute to elucidating the scientific essence of Biejiajian Pills’ multi-way and multi-level anti liver fibrosis function.

肝癌前病变的早期防治对于降低肝癌的发病率及死亡率具有重要的临床意义。基于鳖甲煎丸抗肝纤维化、肝硬化及肝癌研究的良好工作基础，以及肝卵圆细胞上皮间质转化与肝癌前病变密切相关的研究进展，本研究拟以肝卵圆细胞上皮间质转化为切入点，以大鼠肝卵圆细胞模型、大鼠肝癌前病变动态动物模型及临床肝癌患者术后肝脏病理组织标本为研究对象，采用质粒转染、基因沉默、免疫荧光检查及PCR等技术，探讨PI3K/AKT/GSK-3β信号通路调控肝卵圆细胞上皮间质转化向肝癌细胞恶性增殖转化的癌变机制。同时，应用活体小动物瘤体成像动态观察和免疫组织化学法等技术，研究鳖甲煎丸是否通过干预肝卵圆细胞上皮间质转化而达到抗肝癌前病变的分子机制。本研究对筛选肝癌前病变的诊断、治疗及预后的有效指标和寻找新的治疗靶点具有重要的临床价值，亦有助于进一步诠释鳖甲煎丸多途径、多层次抗肝癌前病变的科学内涵。

本研究拟以肝卵圆细胞上皮间质转化（EMT）为切入点，以大鼠肝卵圆细胞（HOC）模型、肝癌前病变动物模型及临床病例为研究对象，采用Western blotting、免疫组织化学法等技术，探讨PI3K/AKT/GSK-3β信号通路调控肝卵圆细胞EMT向肝癌细胞恶性增殖转化的癌变机制。同时，应用活体小动物瘤体成像动态观察、转录组学测序等技术，研究鳖甲煎丸是否通过干预HOC的EMT而达到抗肝癌前病变的分子机制。同时收集临床标本，观察肝硬化合并肝癌患者肝脏病变组织HOC的EMT情况，检测相关信号分子及靶基因，进一步验证肝癌前病变发生的分子机制。.体外研究结果表明，TGF-β1刺激4d后，WB-F344细胞可出现明显EMT表型；加入鳖甲煎丸含药血清可逆转EMT，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路的激活有关。大鼠肝癌前病变模型研究表明，与模型组对比，在肝纤维化阶段给予鳖甲煎丸可改善肝功能，通过降低炎症因子表达，降低肝脏表面＞5mm结节（不典型增生结节或肝癌结节）数量，从而抑制肝癌前病变的发生发展。而肝硬化阶段给予鳖甲煎丸，不能降低模型大鼠肝癌的发生，但可显著降低肝癌组织中TGF-β1及p-smad2的表达水平，进一步降低PI3K/AKT/GSK-3β信号通路下游靶基因N-cadherin、Vimentin的表达水平，从而抑制EMT的发生，达到抗肝癌转移目的。在小鼠肝癌前病变模型中，转录组学及生物信息学分析结果表明，与模型组相比，鳖甲煎丸组小鼠癌前病变组织中，有330个差异基因发生明显变化，主要与胆固醇合成、细胞焦点粘接、凋亡、癌症通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路等相关，鳖甲煎丸可能通过抑制癌变组织中血小板衍生生长因子β受体（PDGFR-β）的表达，抑制肝癌前病变的发生发展。收集的肝硬化增生结节合并原发性肝细胞癌患者术后病理组织中，肝硬化结节组织内有肝卵圆细胞增生，肝癌可能起源于卵圆细胞异常分化。.本研究对筛选肝癌前病变的诊断、治疗及预后的有效指标和寻找新的治疗靶点具有重要的临床价值，亦有助于进一步诠释鳖甲煎丸多途径、多层次抗肝癌前病变的科学内涵。