基于酶蛋白再激活构筑重金属电化学免疫传感器的研究

Metal pollution poses a serious threat to human health, detection of heavy metals in environmental samples is the key to the prevention of heavy metal pollution. The aim of the present study is to establish a novel and rapid method to determine the heavy metals on spot, which is based on the oxidation of glucose and combined the advantages of electrochemical and immunoassay. The chelated metal complex is used as unlabeled hapten, the labeled hapten is produced by coupling flavin adenine dinucleotide (FAD) with unlabeled hapten, and then the labeled and unlabeled hapten are competed with antibody specific heavy metal. Glucose oxidase (GOx) can be reconstituted by the apo-glucose oxidase immobilized on the electrode with FAD or FAD analogues, which does not react with antibody. Trace heavy metal can be detected according to the electrochemical response of glucose. The method is highly sensitive and selective, and using this method, GOx can be dissociated in acid conditions and can be reconstituted in neutral conditions. It overcomes the weakness of poor regeneration of electrochemical sensor and improves the utilization rate of sensors. It provides a new idea and method for rapid, efficient and distinctive detection of heavy metals.

重金属污染严重威胁到人类的身体健康，环境样品中重金属的检测是预防重金属污染的关键。本项目的目标是在葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的基础上结合电化学和免疫分析的优点，构建一种新型的重金属现场快速检测方法。其策略是以葡萄糖氧化酶酶蛋白修饰电极构建传感器，将重金属离子和螯合剂螯合后作为非标记重金属半抗原，用葡萄糖氧化酶辅酶标记重金属半抗原，标记半抗原和非标记半抗原与重金属抗体发生竞争性免疫反应后，未参与反应的葡萄糖氧化酶辅酶将可激活固定在电极表面的葡萄糖氧化酶酶蛋白重组全酶以氧化葡萄糖，基于葡萄糖的电化学响应可检测痕量重金属。这一方法将具有高灵敏度和高选择性的特点，并可充分利用葡萄糖氧化酶在酸性条件下解离和中性条件下重组的优势，克服电化学传感器再生性差的弱点，提高传感器的使用率，为重金属的快速、高效和特异性检测提供了新的思路和方法。

重金属残留给人类健康带来了严重威胁，因此，迫切需要研究能对其进行快速准确的检测方法。本课题基于葡萄糖氧化酶在酸性条件下解离中性条件下重构全酶建立了快速、准确、灵敏的重金属Cd2+和Pb2+残留免疫电化学检测方法。具体内容如下:.1） 酸性饱和硫酸铵沉淀法制备出高纯度葡萄糖氧化酶酶蛋白。经紫外可见图谱和全酶活性重构鉴定，结果表明，酶蛋白回收率为80%，与FAD重构活性达到全酶活性的90%以上，活性位点FAD浓度为1.92 nmol/L，且残留低于0.01%。.2）FAD腺嘌呤核糖核苷酸上N6 经“链臂”修饰成N6-(2-aminoethyl)-FAD和N6-(6-aminohexyl)-FAD，FAD衍生物和FAD分别标记金属螯合物成标记半抗原，经与酶蛋白重构全酶活性和免疫活性评价。发现N6-(2-aminoethyl)-FAD与酶蛋白重构全酶活性高达79.3%，标记半抗原与非标记抗原与抗体结合能力接近，因此N6-(2-aminoethyl)-FAD为最佳的FAD衍生物将用于本项目后续实验。.3）优化工作条件，酶标板上建立Cd2+和Pb2+的酶蛋白激活免疫测定系统(ARIS)。发现OD值与Cd2+和Pb2+的浓度成正相关，Cd2+和Pb2+的检测线性范围分别是：0.83~26.4 ng/mL 和53.7~483.7 nM， 50%抑制浓度分别是7.27 ng/mL和92.3 nM，此结果远低于环境水中Cd2+和Pb2+的最大允许值。.4）通过共价键作用和原位还原法制备了金纳米粒子/壳聚糖-石墨烯纳米复合材料(AuNPs/CS-GP)。UV-vis、FTIR、TEM对所合成的纳米复合物的结构和形貌进行了表征。通过静电作用固定Apo-GOx，构建 Apo-GOx/AuNPs/CS-GP修饰的电极。该修饰电极不仅可与FADb标记半抗原成功地重构全酶实现电极间的电子转移, 还对葡萄糖表现出良好的催化性能。FAD衍生物浓度（10-6M）和重构时间（≤0.5小时），可显著降低FAD衍生物在电极的干扰。.5）建立Cd2+和Pb2+的电化学免疫分析方法，考察传感器分析性能。对Cd2+和Pb2的响应线性范围为0.095-83.7 ng/mL和 2.35～866.9 nM，最低检测限分别是0.043 ng/mL和1.98 nM。水样中添加回收率平均为79.7%和82.3%。