柔肝化纤颗粒促BMSCs归巢、转分化为肝样细胞的作用研究

The treatment of cirrhosis is a medical problem，BMSCs transplantation has a high potential on treating cirrhosis ,but its rare content and homing ability limit the expected effects. In our previous study, we found that rouganhuaxian granules can promote BMSCs proliferation and the differentiation into hepatocyte-like cells, as rouganhuaxian granules has synergistic effect on BMSCs. The project molded rats liver cirrhosis or rats BMSCs cell suspension, intervened by rouganhuaxian granules or drug-serum,taking G-CSF as positive control drug. The liver migration rate of stem cells is detected by Immunofluorescence. This research used  the technology of flow cytometry or RT-PCR to detecte the Stem cell markers (CD105, CD90, CD45) and liver cell markers (ALB, AFP, CK-18)expression in the BMSCs and Cell Culture Supernatant ,peripheral blood, bone marrow and liver . It used  the technology of MTT to detect the proliferation of BMSCs ; it used Laser scanning confocal microscope to observe the morphological changes of cells . It detected glycogen storage, lipid metabolism, drug metabolizing function, lipid synthesis of urea and urea synthesis by PAS ,Oil red Obtaining, ICG uptake assay and enzyme assay of two. We want to explore possible the mechanism that rouganhuaxian granules can promote BMSCs proliferation, homing, transdifferentiation into hepatocyte-like cells and BMSCs synergistic effects. It may lay a foundation for the prevention of cirrhosis.

肝硬化的治疗是医学界难题，BMSCs移植对肝硬化具有潜在的治疗价值，但其在骨髓中含量极少且归巢能力有限影响预期疗效。我们前期研究发现柔肝化纤颗粒与BMSCs移植具有协同增效抗肝纤维化作用，能诱导BMSCs增殖、转分化为肝样细胞。本项目复制大鼠肝硬化模型或制备大鼠BMSCs，给予柔肝化纤颗粒药液或含药血清干预，以G-CSF作为阳性对照药物。采用免疫荧光检测干细胞肝脏迁移率，流式细胞术或RT-PCR法检测BMSCs及其上清液、外周血、骨髓、肝组织中CD105、CD90、CD45及ALB、AFP、CK-18的表达，MTT比色法检测BMSCs增殖活性，激光共聚焦显微镜观察细胞形态学变化；分别应用PAS及油红O染色、ICG摄取、酶两点法检测细胞储存糖原、脂质和药物代谢及合成尿素功能，阐明该方促BMSCs增殖、归巢、转分化为肝样细胞及其联合BMSCs移植协同增效的作用及可能机制，为肝硬化防治奠定基础。

我国是慢性肝病的多发国家，乙肝病毒性肝炎感染率和发病率居世界第一，肝硬化是严重危害人民健康的重大疾病，其治疗是目前医学界难题。临床证实柔肝化纤颗粒联合自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）治疗乙肝肝硬化能明显改善肝功能、肝硬化程度、Child-Pugh评分。本研究通过复制CCl4复合因素大鼠肝硬化模型实验及细胞培养实验探讨柔肝化纤颗粒诱导BMSCs向肝细胞分化效果及其作用机制。方法：利用肝硬化大鼠模型，通过柔肝化纤颗粒联合进行干预，应用HE染色、Masson染色评估炎症及肝纤维化程度，PAS染色检测肝脏储存糖原功能，采用冷冻切片检测携带绿色荧光蛋白的BMSCs向肝组织归巢情况，PCR检测肝组织中AFP、ALB、CK18表达。细胞实验利用体外培养的BMSCs，通过柔肝化纤颗粒含药血清进行干预，利用MTT、流式细胞术增殖及标志物的表达，qPCR、Western Blot检测细胞AFP、ALB及CK-18 mRNA及蛋白的表达及其相关机制mRNA及蛋白的表达，糖代谢、脂代谢、药物代谢、尿素合成等方法观察BMSCs向肝细胞分化效果。通过实验发现：动物部分：与模型组相比，使用柔肝化纤颗粒联合BMSCs移植组肝脏组织AFP、ALB、CK18表达上调，HGF、EGF表达上调，肝脏内携带绿色荧光蛋白的BMSCs数量增加，纤维化程度下降（P＜0.05）。与单独BMSCs移植组相比，柔肝化纤颗粒联合BMSCs干预组大鼠肝脏干细胞粘附相关基因和干细胞归巢相关基因mRNA及蛋白表达量显著上调（P＜0.05），柔肝化纤颗粒联合干预组大鼠肝脏内携带绿色荧光蛋白的BMSCs数量增加。细胞部分：与空白对照组相比，柔肝化纤颗粒和G-CSF可诱导BMSCs定向分化为肝样细胞，促进其合成糖原、脂肪及分泌尿素的能力显著；同时可显著增加AFP、ALB、CK18基因表达；同时CXCR4 mRNA及蛋白表达升高；与对照组相比，添加高浓度柔肝化纤颗粒含药血清能够显著上调BMSCs归巢相关基因mRNA及蛋白表达量（P＜0.05），表明柔肝化纤颗粒能够促进BMSCs定向分化为肝样细胞，并促进其向纤维化肝组织归巢，同时能够提高肝脏募集干细胞聚集水平，其机制与上调CXCR4的表达有关，为临床上延缓甚至逆转肝纤维化提供依据。