小分子诱导的人肝样细胞转分化及其机制研究

Tissue repair using functional cells derived from transdifferentiation is an important topic to study in regenerative medicine. So far hepatic transdifferentiation has only been achieved with lentivirial delievery of hepatic-specific transcription factors, which confers safety risks in clinic. To avoid the risk, it is necessary to establish a small molecule based approach for hepatic transdifferentiation. In the current study, we will establish a high content screening platform for the process based on automatic quantification of EGFP fluorescence signal driven by the hepatic-specific ALB promoter. Using this platform, small molecules that promote transdifferentiation or that replace transcription factors will be identified. Their activities in vitro and in vivo will be examined. Eventually, Chemical-induced hepatic transdifferentiation that is capable of repair liver damage will be achieved. Meanwhile, chemical genomics analysis will be conducted to identify novel genes and signaling networks that regulate hepatic transdifferentiation. The findings from this project will help us better understand the mechanisms of hepatic transdifferentiation and serve as a basis for further investigations of liver repair through transdifferentiaion.

通过转分化获得功能细胞并进行组织修复是再生医学的重要研究方向。目前国内外建立的肝细胞转分化的体系均由携带转录因子的病毒载体诱导，为了避免应用病毒载体带来的潜在危险性，有必要建立一种安全有效的由小分子化合物介导的人肝细胞转分化体系。本研究将构建一个人肝细胞转分化的高内涵筛选体系，该体系通过自动定量化检测由肝细胞特异的标志物ALB启动子驱动的EGFP荧光信号来报告转分化事件。应用该体系，我们将筛选促进转分化和替代各个转录因子的活性小分子，并进一步验证活性小分子在体外和体内调控人肝样细胞转分化的作用，以期最终获得由全化学诱导转分化的具有组织修复功能的人肝样细胞。同时，我们也将依据化学基因组学研究手段鉴定肝细胞转分化的新的调控基因和信号调控网络。本课题的研究将使我们更好的了解肝细胞转分化的机理，并为实现由转分化介导的肝脏修复奠定基础。

CRISPR/Cas9系统因其能够简单、高效以及特异性的靶向基因组序列，已经迅速应用于生物学研究包括药物研发、疾病治疗以及畜牧业等的各个领域，并且有望将来应用于基因治疗领域。为了调控CRISPR/Cas9在适当的时间和空间产生基因编辑及转录激活的作用，我们希望能够开发一种可药物诱导调控的CRISPR/Cas9系统能够对细胞内基因组进行基因编辑和/或转录激活。首先，我们设计并构建了一系列Cas9与ERT2组合的融合蛋白。通过将含有EGFP的Cas9与ERT2组合的质粒转染至HEK293细胞内后，加入4OHT处理细胞48h后高内涵分析细胞核与细胞质内绿色荧光强度，表明只有Cas9-ERT2和Cas9-ERT2-ERT2组存在明显的4OHT诱导其进入核的效应。随后，我们分别使用效率高低的不同的sgRNA检测不同ERT2与Cas9融合时其对Cas9内切酶活性的影响，结果显示C端存在2个ERT2时其内切酶活性几乎没有被影响。接下来，我们流式细胞检测了Cas9-ERT2-ERT2和Cas9-ERT2的组合对HEK293细胞内CD201基因的诱导敲除效应，结果表明与对照组相比Cas9-ERT2-ERT2具有4OHT诱导调控的内源性基因的敲除效应。同时，我们采用抗生素筛选富集转染Cas-ERT2-ERT2和CD201 sgRNA-1质粒的细胞后，分析各组细胞CD201表达的改变以及切割位点的NHEJ效应，同样结果表明与对照组相比Cas-ERT2-ERT2具有4OHT诱导调控的内源性基因的敲除效应和靶向切割位点的NHEJ效应。最后，我们通过采用Traffic light reporter系统确认了4OHT能够有效的诱导Cas9-ERT2-ERT2对细胞内基因组的特异性位点切割后产生有效的NHEJ和HDR效应，但是此系统本底效应较高。随后，我们构建、优化并评价了Cas9-2NES-2ERT2系统具有有效的诱导调控基因编辑的效应，同时消除了非特异诱导的本底效应。此外，我们还建立了一种基于Cas9 的能够同时进行基因编辑及基因转录激活的HIT2系统。这种诱导型的Cas9ERT2系统的建立为后续的CRISPR/Cas9系统在动物模型的构建和基因治疗等方面的应用提供了一个有效的工具。