自吞噬在甲氨蝶呤诱导类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞凋亡中的抗凋亡作用研究

Methotrexate (MTX), as the most commonly used medicines to treat rheumatoid arthritis (RA)，mainly cause apoptosis of synovial cells. Recently it is found that MTX can enhance autophagy which inhibits apoptosis in tumor cells research. We infer that autophagy can also be enhanced by MTX to inhibit apoptosis of RA synovial fibroblasts, but the mechanism is not yet clear. This subject at first value the expression of autophagy of synovial tissue from RA, combined with their MTX-taking history, to analyse its correlations between MTX and autophagy in RA. Then, investigate the variation of autophagy markers induced by various dosages of MTX in different time in RA synovial fibroblasts to verify their relationship. Furthermore, The activation of signaling pathway and the expression of autophagy factors and microRNA will be detected to make clear how MTX induce autophagy in RA synovial fibroblasts. On those bases, after inhibiting MTX-induced autophagy in both RA synovial fibroblasts and animal model using either small interfering RNA or autophagy inhibitor, we detect the apoptosis biomarkers associated with autophagy in both vivo and vitro, so that the inhibition roles of autophagy on MTX-induced apoptosis in RA synovial fibroblasts can be illustrated. It will be conducive to compensating for the defects of RA chemotherapy and to providing the theory basis for reducing medicine resistance.

甲氨蝶呤（MTX）治疗类风湿性关节炎(RA)主要机制是促进滑膜细胞凋亡。近年发现，在MTX治疗肿瘤中，自吞噬可被增强而抑制细胞凋亡，引起MTX药效降低。我们推测自吞噬在MTX治疗RA中也可被增强而抑制滑膜细胞凋亡导致耐药，具体机制尚不明确。本课题拟先检测RA患者滑膜组织自吞噬指标的表达及定位，结合患者既往使用MTX情况，分析MTX和自吞噬的相关性；进而观察RA滑膜成纤维细胞在MTX刺激下不同剂量、不同时间自吞噬指标的变化，确定两者间的关系；检测自吞噬调节通路的激活、相关调节因子和microRNA的表达，明确MTX对RA滑膜成纤维细胞自吞噬的调节机制；最后，在RA滑膜成纤维细胞和RA动物模型上，通过小RNA干扰及自吞噬抑制剂抑制自吞噬激活，观察MTX作用下相关调亡因子的变化，阐明自吞噬抑制MTX诱导RA滑膜成纤维细胞凋亡的机制。这将为了解MTX治疗RA中的耐药机制，提高药物疗效提供理论依据。

1、背景：.甲氨蝶呤（methotrexate MTX）是应用最为广泛的改变病程类抗风湿药（disease- modifyingantirheumatic drugs，DMARD），是治疗类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）的首选药物之一，但由于MTX的长期使用，患者不良反应发生率也随之增加，且导致了不同程度的耐药性的产生。近年研究发现，RA滑膜衬里层自吞噬明显增高，而且体外实验表明自吞噬在不同的应激条件下对RA成纤维样滑膜细胞（RA synovial fibroblasts,RASFs）凋亡起着截然相反的作用。但是，自吞噬在MTX治疗RA过程中所起的作用尚缺少相关研究。 .2、目的和意义：.观察自吞噬在未使用过甲氨蝶呤、正在使用甲氨蝶呤的RA患者滑膜及退行性骨关节炎（Osteoarthritis, OA）滑膜中的表达情况；探究自吞噬与MTX诱导的RASFs凋亡、增殖、细胞侵袭迁移及细胞活性的关系，为MTX治疗RA耐药机制的研究提供新的思路。.3、内容：.1）自吞噬在滑膜组织中的表达情况：使用免疫组织化学、Realtime qPCR、Western blot方法检测滑膜组织自吞噬相关蛋白Beclin1和LC3B；透射电子显微镜检测组织中自吞噬泡的形成。.2）RASFs的提取及鉴定：采用复合酶消化法提取RASFs；免疫组织化学法检测波形蛋白的表达用以鉴定RASFs。.3）在体内及体外研究自吞噬干扰前后MTX对RASFs凋亡、增殖、侵袭迁移、细胞活性及自吞噬形成情况的研究。.4、结果：.1） 自吞噬在RA中表达明显高于OA（p＜0.05），但是在未使用过甲氨蝶呤与正在使用甲氨蝶呤RA患者间没有统计学差异（p>0.05）。.2） MTX可以诱导RASFs自吞噬的形成，适度诱导细胞凋亡，但对RASFs增殖、侵袭迁移及活性没有明显影响。.3） 抑制RASFs自吞噬的表达后，MTX诱导细胞凋亡增加，细胞增殖减缓，活性降低，侵袭及迁移降低。.5、科学意义：.自吞噬在MTX治疗RA耐药性中发挥着重要的作用，其作用是通过抑制MTX诱导的RASFs凋亡，促进RASFs的增殖，促进细胞的侵袭迁移实现的。自吞噬有望成为MTX耐药机制研究的新方向。.