“失合刺治丸”对大鼠脑缺血再灌注PI3-K/AKT通路的影响

It is very important to seek a kind of effective means preventing and treating ischemic cerebral vascular disease, which is one of the highest mortality rate of the three human diseases."Shihecizhiwan" is a prescription of prevention and treatment of ischemic cerebral vascular disease. It is a typical prescription in the classical medical of the Hui-medicine-Huihuiyaofang. This project aims to study the "Shihecizhiwan" on the PI3-K/AKT signal pathway in cerebral ischemia-reperfusion injury on the basis of effective clinical treatment in the early time. This project make model of focal cerebral ischemia-reperfusion by the thread occlusion. 156 SD rats will be divided into four groups, namely surgical group, control group, "Shihecizhiwan " group and the normal group, then we will evaluate the nervous system signs at respective 12h, 24h, 72h, points. After death, we will observe pathological changes in brain issues, count apoptosis brain cells in ischemia-reperfusion by TUNEL, detect the expression of AKT/PKB protein levels by Western-Blot and immunohistochemical staining method and mRNA RT-PCR. This study seeks to clarify "Shihecizhiwan" mechanism of treating ischemic cerebral vascular diseases and to further develop the Chinese Hui-medicine. The project will provide experimental basis on prevention and treatment of ischemic cerebral vascular disease.

缺血性脑血管病是目前人类死亡率最高的三大疾病之一，积极地寻求有效的防治之法意义重大。"失合刺治丸"是回医药经典著作- - 《回回药方》防治缺血性脑病的代表方药。本项目在前期运用"失合刺治丸"临床治疗缺血性脑病取得肯定疗效的基础上，拟进一步开展实验研究"失合刺治丸"对脑缺血再灌注PI3-K/AKT信号通路的影响。本研究采用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型，将156只SD大鼠分为假手术组、对照组、失合刺治丸组及正常组共四组，于造模后12h、24h、72h三个时间点对其神经系统体征进行客观评分，断头处死后，分别观察各时间点脑组织病理学形态改变、TUNEL法观察缺血再灌注24h凋亡情况，Western-Blot与免疫组化法检测AKT/PKB酶蛋白水平及mRNA RT-PCR的表达等。冀此探讨"失合刺治丸"治疗缺血性脑血管病的作用机制，为进一步开发和运用中国回医药经典方剂防治缺血性脑血管病提供实验依据。

采用线栓法制备脑缺血再灌注大鼠模型，研究失荅剌知丸对该模型PI3-K/AKT通路影响，同时开展失荅剌知丸低、中、高剂量组以及失荅剌知丸联合金纳多组对该模型影响的研究。（1）对PI3-K和AKT的影响：失荅剌知丸能促进神经功能恢复，各治疗组与模型组PI3-K、AKT比较(P＜0.01)，尤以失荅剌知丸组差异最显著。（2）对Casepase-3和Casepase-9的影响：电镜显示：与模型组比较，失荅剌知丸组各时间点上细胞、突触、毛细血管的损伤程度逐渐恢复，尤以72h恢复最好；与模型组比较，失荅剌知丸组各时间点Caspase-3和Caspase-9蛋白表达明显降低(P＜0.01)；与金纳多组比较，失荅剌知丸+金纳多组在72h时Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著降低（P<0.01）。（3）对NF-KB的影响：免疫组化、蛋白免疫印迹及RT-PCR结果显示：与金纳多组比较，失答剌知丸各剂量各时间点NF-κB蛋白表达差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），其中失答剌知丸高剂量组各时间点NF-κB蛋白明显减少（P<0.01）。（4）对Fas和FasL的影响：假手术组各时间点Fas、FasL的表达均为最低；模型组各时间点Fas、FasL的表达均为最高；较模型组比较，各用药组Fas、FasL的表达均降低；较阳性药物对照组比较，失荅剌知丸高剂量组的Fas和FasL表达减少明显，以72h减少显著。（5）对Bax和Bcl-2的影响：与阳性对照组比较，失荅剌治丸组各时间点bcl－2表达显著增高(P＜0.01)，bax蛋白表达显著降低(P＜0.01)。（6）对NGF的影响：大鼠海马区及齿状回NGF阳性细胞的表达5组间差异有统计学意义，失荅剌知丸各组NGF阳性细胞数较金纳多组增加(P＜0.05)，并且随着失荅刺知丸剂量的增加NGF阳性细胞数逐渐增加(P＜0.05)。（7）对HSP70的影响：失荅剌知丸组各时间点HSP70蛋白表达高于金纳多组(P＜0.01)，较金纳多组比较，失答剌知丸组HSP70蛋白表达随时间延长逐渐升高(P＜0.05或P＜0.01)。