基于Wnt/β-catenin通路调控自噬介导电针的脑缺血耐受机制

Electroacupuncture(EA) is widely used in the treatment of cerebral infarction, but the mechanism remains unclear. The function of autophagy in cerebral ischemic tolerance of EA is the central issue of current research. Inoki’ s study suggested that blocking Wnt signaling could prohydrolyze mTOR which can regulate the autophagy, and increased autophagy. We found that Wnt signaling involved in the cerebral ischemic tolerance of EA, while blocking beta-catenin in Wnt signaling could reverse the function of EA. Whether the effect of cerebral ischemic tolerance could be mediated by EA，Wnt/ beta-catenin and autophagy, there was no interrelate research. So we propose scientific hypothesis: EA can activate Wnt signaling, which can inhibit the degradation of beta-catenin and increase mTOR content, thereby the autophagy of neuron can be reduced, then EA can achieve cerebral ischemic tolerance. We will establish LPR6 konckout and wild type (WT) middle cerebral artery occlusion (MCAO) mice and Neuron Oxygen and glucose deprivation (OGD) / reperfusion model. We will respectively use TUNEL, Western blot, cell culture and viral transfection technology and observe the changes of behavioristics, apoptosis , autophagy, autophagy protein and other indicators. We will demonstrate that the Wnt / beta-catenin signaling can regulate autophagy in mediating cerebral ischemia tolerance of EA by the changes of Wnt signaling proteins, apoptosis , autophagy, autophagy protein and other indicators. This research will provide scientific basis for EA treatment of cerebral infraction.

电针广泛用于治疗脑梗塞，但机制仍不明确。自噬在电针脑缺血耐受的作用是目前研究的热点。Inoki研究表明阻断Wnt信号可促进自噬调控蛋白mTOR水解，增加自噬发生。课题组发现Wnt信号参与了电针脑缺血耐受，而阻断Wnt通路第二信使β-catenin可逆转电针效应。但电针、Wnt/β-catenin通路、自噬三者如何相互作用介导脑缺血耐受，尚无类似研究。因此，课题组提出科学假说：电针通过激活Wnt信号，抑制β-catenin降解，增加mTOR含量，从而减少自噬发生，达到脑缺血耐受。本研究拟建立LPR6KO与WT MCAO小鼠以及神经元OGD/Rep模型，分别运用TUNEL、WB、细胞培养和病毒转染等技术，观察行为学、自噬标记蛋白、凋亡与自噬体等指标变化，分别从整体、细胞、分子等不同层面，论证Wnt/β-catenin通路调控自噬介导电针脑缺血耐受。本研究将为电针治疗脑梗塞提供科学依据。

研究背景：脑梗塞是危害人类健康的主要疾病之一，电针百会穴可以通督醒脑，因此被广泛接受用于脑卒中的治疗，但是其机制仍未明。有研究表明自噬与脑缺血损伤以及Wnt信号通路有关。但电针是否通过Wnt信号通路来抑制自噬达到脑缺血耐受的效应，目前尚未阐明。为此，本研究通过建立大鼠MCAO模型与神经元氧糖剥离再灌注（OGD/R）模型，研究Wnt信号通路在抑制自噬介导电针脑缺血耐受中的作用及机制。.以下四部分研究内容：.1、电针对MCAO大鼠Wnt信号通路的影响。包括观察电针预处理对MCAO大鼠脑内Wnt信号通路的影响；观察Wnt通路拮抗剂Dkk-1与激动剂氯化锂（LiCl）对电针脑保护的影响。.2、电针预处理对MCAO大鼠自噬的影响。包括观察电针预处理后正常大鼠脑内β-catenin与GSK3β的含量；观察电针与LiCl对脑缺血耐受与抑制自噬的作用。.3、Wnt通路在对糖氧剥夺(OGD/R)皮层神经元自噬中的影响。通过建立OGD/R神经元模型，分别给予LiCl,β-catenin过表达病毒与GSK3β敲低病毒，分别观察神经元活性，自噬相关蛋白P62，LC3II/LC3I，雷帕霉素靶蛋白（pmTOR / mTOR），以及Wnt信号通路中的GSK3β,β-catenin等蛋白变化。.4、抑制GSK-3β的磷酸化对电针MCAO大鼠的影响。观察在电针预处理前给予GSK3β磷酸化抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin)对MCAO大鼠脑内自噬蛋白与神经元存活度的影响。.研究结果：在体实验表明电针预处理可以激活Wnt信号通路达到脑保护效应。电针可上调大鼠脑内β-catenin以及GSK3β含量，改善MCAO大鼠行为学，降低脑梗死体积，抑制自噬，LiCl与Wortmannin可以分别模拟与逆转电针抑制自噬的作用。离体实验表明Wnt信号通路中的GSK3β可以通过抑制自噬来达到保护神经元的作用。.科学意义：本研究通过在体与离体实验，通过药理学与遗传学方法来阐明了Wnt通路中GSK3β通过抑制自噬介导了电针的脑缺血耐受效应。本研究的成果将有利于推动电针治疗脑梗塞的机制研究，并进一步完善电针治疗缺血性脑损伤的理论基础和科学依据。