体外构建角膜内皮细胞膜片行后弹力层内皮移植后的功能评价

角膜内皮细胞对维持角膜的正常厚度和透明性十分重要，一旦角膜内皮细胞的密度低于维持其生理功能的临界值就会引起不可逆病变。角膜内皮移植手术成为现今治疗内皮病变的首选术式，但供体匮乏仍然制约着手术的广泛开展。本课题以同/异种角膜后弹力层为支架材料，以体外培养的角膜内皮细胞为种子细胞，构建细胞膜片，行后弹力层内皮移植术（Descemet membrane endothelial keratoplasty，DMEK）治疗内皮损伤的新西兰白兔，术后评价移植细胞与周围组织的结构重建、功能恢复情况及免疫排斥发生的情况。本课题从种子细胞来源、载体材料、移植方法及免疫排斥等四方面进行设计和研究。为组织工程角膜内皮膜片的开发提供依据，为进一步应用到临床奠定基础，为未来角膜内皮疾病的治疗开辟新的途径。

角膜内皮细胞对维持角膜的正常厚度和透明性十分重要。人角膜内皮细胞在体内不可再生，一旦损伤，细胞数量会明显降低，严重者引起角膜内皮失代偿。目前，角膜内皮移植术已成为治疗角膜内皮病变的最佳术式，但角膜内皮供体材料的缺乏是临床亟待解决的问题。本课题通过合适的种子细胞筛选，同种及异种后弹力层载体制备后，构建细胞膜片，对不同种属内皮细胞膜片的功能进行比较。结果表明通过胰酶消化法分离培养的兔角膜内皮细胞类似正常细胞的六边形形态。RT-PCR见角膜内皮细胞表达COL4A2、FLK1、ATP1A1等相对特异性基因。免疫荧光见角膜内皮细胞NSE、Na+-K+-ATP酶、Zo-1呈阳性表达。通过大气泡法成功分离了完整的猪角膜后弹力层，以其作为载体构建细胞膜片后，细胞生长状态良好，HE染色和DAPI染色均可见形成单层细胞，茜素红染色可见其形态类似六边形，扫描电镜结果显示细胞间形成紧密连接，细胞与后弹力层紧密贴附。免疫荧光检测可见Na+-K+-ATP酶呈阳性表达。本课题以培养的兔角膜内皮细胞为种子细胞，以同/异种角膜后弹力层为支架材料，构建膜片后主要从光镜、茜素红染色、电镜及免疫荧光等四个方面对其进行评价，为后期的移植手术奠定基础，为组织工程角膜内皮膜片的发展提供了依据，为未来临床角膜内皮疾病的治疗开辟新的途径。