子宫颈癌中HPV E6对hTERT基因调控的研究

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染已被确定是宫颈癌的致病因素。人端粒酶在宫颈癌中活性增强，主要是由于HPV16、18 E6上调了人端粒酶逆转录酶(hTERT)水平，但E6如何调控hTERT基因尚不明确。本研究目的：探讨HPV E6基因如何通过DNA甲基化和组蛋白修饰来调控hTERT表达、从而促进端粒酶活性、导致宫颈上皮细胞恶变的机制。主要内容：①进一步明确宫颈癌细胞中hTERT基因启动子甲基化水平和组蛋白修饰，确定关键性CpG位点；②通过siRNA干扰HPV阳性的宫颈癌细胞系中的E6基因，同时干扰永生化的人宫颈上皮细胞中的E6基因-再将E6转染入此细胞中，检测干扰/转染前后hTERT表达及其启动子DNA甲基化和组蛋白修饰的调控改变、以及细胞生物学行为变化。以期揭示E6通过调控hTERT基因致癌的机制，为阻断宫颈癌的发生提供理论基础。

在hTERT启动子上游和中游区域（-624至-200bp）均呈甲基化，但转录起始点附近（-156～+162bp）为低甲基化状态。siRNA干扰E6基因后，hTERT mRNA水平显著均显著下降（大于70%,48小时内）；而P53和P21蛋白水平则明显升高。Caski和Siha细胞系hTERT启动子关键性CpG位点甲基化水平在siRNA干扰后升高，而Hela则无明显变化。人宫颈癌细胞Hela、Siha、caski中均能分离出SP细胞，其所占比例分别为1.07±0.32%、0.83±0.76%和0.4±0.1% 。对Hela细胞分选出的SP和non-SP细胞生物学特性研究结果：①表面标记物检测显示：Oct3/4、CD133及乳腺癌耐药蛋白（BCRP）在SP细胞中表达明显高于non-SP细胞②随着SP与non-SP细胞注射剂量的减少，NOD/SCID鼠致瘤率下降，致瘤潜伏期明显延长，并且形成的瘤体体积逐渐减小，但是在SP与non-SP细胞之间比较致瘤潜伏期、致瘤率及瘤体体积没有显著差异性；③组蛋白去乙酰化酶抑制剂（曲古霉素，TSA）对SP细胞的抑制作用明显高于non-SP细胞及未分选的Hela细胞；④SP细胞在射线照射后，其较non-SP和Hela细胞更高。基因芯片的检测结果显示: 61个miRNA和2767个mRNA在Ect1/E6E7与Siha细胞系之间有差异表达,其中34个miRNA和1138个mRNA在在宫颈癌细胞系中上调，27个miRNA和1629个mRNA在宫颈癌细胞系中下调。关联后的miRNA-gene-Network调控网络图结果显示let-7家族，miR-200家族、miR-15a、miR-23b、miR-34a、miR-155、miR-424在网络调控中处于核心位点，这些核心位点的miRNA在HPV介导的恶性转化中可能发挥着重要的调控作用。宫颈癌组hTERT mRNA阳性率明显高于CIN组和正常宫颈组。与hTERT mRNA检测结果相比较，宫颈癌组和CIN组中HPV E6基因均为阳性，对比TERT阳性者和TERT阴性者的HPV E6基因相对表达量，结果无显著差异。