基于宏基因组学的降解海藻浒苔微生物群落结构与功能研究

Enteromorpha prolifera (EP), a green alga in the division Chlorophyta, is well known for its high contents of carbohydrate and crude fibers. As a potential biomass material, EP has important uses and practical values in the biomass energy, food and medicinal industry. In this study, an EP-degrading bacterial consortium D2-1, which obtained from offshore mangrove environment, was isolated. Metagenome of consortium D2-1 will be sequenced by the high-throughput sequencing technology, and then the microbial community structure and metabolic pathway would be analysed with the results of EGTs database and Contig assembly DNA sequencing and gene annotation and functional classification in its entirety. The relationships among strains will be also studied. At the same time, the key functional genes would be obtained and heterologously expressed in E. coli. Furthermore, the recombinant enzymes are purified and characterized. According to our knowledge, this is a more in-depth research on microbial community structure and function of EP-degrading consortium. These results would be conducive to explain the mechanism of functional genes for degradation and provide theoretical foundation and technical support for construction of genetic engineering biofuel-producing bacteria or engineering bacteria of key enzymes. It can also provide with new ways to resolve the marine ecological security issues which are caused by marine alga Enteromorpha prolifera.

浒苔（Enteromorpha prolifera），属绿藻门石莼科，其糖类及粗纤维含量丰富，作为潜在的生物质资源，在生物质能、食品、医药等众多领域中具有重要用途和应用价值。本项目以前期研究获得的海藻浒苔降解菌群D2-1为材料，应用宏基因组高通量测序技术，获得海藻浒苔降解菌群D2-1的宏基因组序列，采用EGTs序列分析及Contig序列组装和基因组功能注释分析，全面解析菌群D2-1微生物群落结构及代谢途径，揭示菌间相互协作关系；获得结构蛋白氨基酸序列信息和降解关键功能基因，并克隆表达关键功能基因，分析酶的性质。这是迄今对海藻浒苔降解菌群结构及其功能方面一个较为深入的研究。研究结果有助于了解海藻浒苔降解过程中功能基因及其作用机理，为构建能发酵海藻浒苔生产生物燃料的工程菌，或能生产高活性关键酶的工程菌，提供理论依据和技术支撑。同时为解决海藻浒苔引起的海洋生态问题提供新途径。

大型绿藻浒苔作为潜在的可再生海洋生物质资源，在生物质能、食品、医药等众多领域中具有重要用途和应用价值，既可提供廉价原料降低生产成本，又能解决浒苔绿潮带来的环境、生态和经济问题。国内外对发酵浒苔产糖菌群的研究十分有限，尚未见应用宏基因组学与宏蛋白质组学技术研究发酵浒苔产糖菌群结构与功能的报道，这是对绿藻浒苔降解菌群结构及功能的一个较为深入的研究。项目利用宏基因组高通量测序技术完成了菌群D2-1的宏基因组序列测定，开展了包括菌群微生物多样性分析、丰度分析以及菌间相互协作关系分析在内的降解菌群微生物群落结构研究，进行了浒苔降解过程中的代谢途径、关键功能基因搜索及分析。同时，应用2D-PAGE及iTRAQ（同位素标记相对和绝对定量）结合2D-LC-MS/MS技术的两种宏蛋白组学分析策略，对菌群全蛋白质进行初步鉴定与分析。项目获得的总测序量为6.59G，平均读写长度约100bp。测序数据组装得到17138个contigs大重叠群，每个contigs平均大小1838bp，N50为4175bp。微生物结构在细菌域上读取率占总数的55.02%，在门水平上最常见的细菌类群是变形菌门（54.26%）和拟杆菌门（0.35%），在属水平上主要为新新鞘氨醇杆菌属（11.24%）、鞘氨醇核菌属（7.92%）和铜绿假单胞菌属（3.37%），在种水平上数量较多的依次为Pseudomonas stutzeri（53.07%）、Sphingopyxis alaskensis（16.91%）、Ochrobactrum intermedium（12.56%）、Ochrobactrum anthropi（3.42%）和Bordetella（2.89%）。浒苔降解菌群关键功能基因搜索及分析中，共发现25个相关的糖代谢酶类家族。完成了木聚糖酶和果胶酶的克隆，分析了木聚糖酶的性质。研究结果揭示了对发酵绿藻浒苔产糖菌群的微生物结构与功能基因，初步阐明了降解海藻浒苔菌群的作用机理及其降解过程中可能代谢途径，为调控绿藻浒苔降解菌群代谢活动、改进菌群结构及提高降解能力提供指导，为构建可发酵绿藻浒苔的高活性关键酶的工程菌提供理论依据和技术支持。