肾炎防衰液通过调节自噬与泛素蛋白酶体降解途径抑制糖尿病肾脏病TGF-β/Smad通路失衡的作用机制研究

Our previous research had confirmed Shenyanfangshuai fluid’s efficacy in diabetic kidney disease (DKD) by inhibiting TGF-β/Smad pathway. So we put forward a hypothesis that its inhibiting effect on TGF-β/Smad pathway may be associated with two protein degradation pathways by activating autophagy and inhibiting ubiquitin-proteasome pathway. In this study we first investigate the relationship between the key proteins of TGF-β/Smad pathway and the two protein-degradation pathways in DKD patients. Then we investigate whether Shenyanfangshuai fluid’s efficacy was associated with activating autophagy and inhibiting ubiquitin proteasome pathway in rat models. And at last further investigate whether Shenyanfangshuai fluid’s efficacy was associated with the two pathways and find the specific protein of TGF-β/Smad pathway they act on via genetic interference or chemical interference in cell models. and finally it is expected to elucidate the meaning of Shenluozhengjia theory on the basic of TCM yin and yang theory .

在前期研究中我们发现肾炎防衰液治疗糖尿病肾脏病（DKD）与抑制TGF-β/Smad通路有关，因此提出假说：其对抗TGF-β/Smad通路失衡与机体两条调控蛋白降解的重要途径有关，其通过激活自噬及阻断泛素蛋白酶体降解通路分别增加了TGF-β/Smad通路中正及负性调控蛋白的降解。本研究首先探讨DKD患者肾脏细胞TGF-β/Smad及两条降解通路中各关键蛋白表达的相互关系；然后借DKD动物模型，探讨肾炎防衰液抑制TGF-β/Smad通路是否与激活自噬或抑制泛素蛋白酶体通路进而增加或减少相关蛋白降解有关，与干预哪些节点有关；最后借DKD致病因素诱导的肾脏细胞模型，以基因干预或化学试剂阻断上述降解通路，探讨肾炎防衰液含药血清是否通过干预上述两条通路发挥作用，并进一步研究其干预TGF-β/Smad通路中哪些关键蛋白的降解，并最终有望基于中医阴阳平衡理论阐明“肾络癥瘕”理论的科学内涵。

糖尿病肾病（DN）不仅是导致终末期肾病重要原因，并且能够显著增加心脑血管疾病的发生率和死亡率。目前在国际上尚无特效治疗DN的方法，寻求包括中医药措施在内的能有效延缓DN进展的方法，降低其发展为肾衰尿毒症的危险具有重要的意义。因此，本课题针对DN，以肾络癥瘕理论为基础，选用肾炎防衰液为代表方剂，研究肾炎防衰液在延缓DN进程中的作用。在前一个国基金发现肾炎防衰液具有防治肾纤维化作用的基础上，本项目进一步研究其抗肾纤维化作用机制与调控细胞内蛋白降解途径的相关性。本研究采用STZ注射配合单侧肾切除方法和DN致病因素诱导的肾脏细胞，分别建立了DN动物和细胞模型，应用UHPLC- Q-TOF MS技术分析肾炎防衰液化学成分，并通过网络药理学对肾炎防衰液治疗DN相关靶点进行预测，结合学科前沿及前期研究基础筛选相关靶点，采用形态学观察、分子生物学、免疫染色等方法，综合分析肾炎防衰液干预DN的作用途径和机制。研究结果显示：（1）肾炎防衰液可改善DN大鼠肾功能及病理损伤，并能对抗高糖状态下足细胞损伤和肾小管上皮细胞早衰；（2）肾炎防衰液对糖尿病状态下肾脏细胞自噬体形成无显著影响，同时能增加肾脏细胞自噬泡降解，改善细胞自噬流受阻的状态；（3）肾炎防衰液上调糖尿病状态下足细胞溶酶体膜蛋白表达，并促进溶酶体新生；（4）肾炎防衰液上调肾小管上皮细胞α-Klotho对抗DN下的自噬应激；（5）肾炎防衰液可通过抗氧化作用改善糖尿病条件下溶酶体膜蛋白表达和溶酶体功能，对抗足细胞损伤；（6）肾炎防衰液可改善高糖状态下肾脏细胞泛素蛋白酶体通路相关蛋白表达，提示肾炎防衰液可抑制DN状态下过度激活的泛素蛋白酶体系统。综上，肾炎防衰液可能是通过上调α-Klotho蛋白及恢复促氧化/抗氧化平衡来疏通自噬-溶酶体降解通路，并抑制泛素-蛋白酶体系统发挥多靶点、多途径效应以对抗糖尿病条件下的肾脏损伤。本研究为DN的防治提供了新的靶标途径，并为肾炎防衰液干预DN的有效作用机制提供了实验依据。