基于乳腺癌细胞生物膜结构特性的抗肿瘤活性肽temporin-1CEa作用机制研究

Cationic antimicrobial peptides (CAPs) are a promising new class of drugs that may avoid the shortcomings of conventional chemotherapy (toxic side effects and the frequent development of multi-drug resistance) because certain CAPs exhibit selective cytotoxicity against a broad spectrum of human cancer cells by a cell membrane-lytic effect. Temporin-1CEa, one novel natural-source CAP, exerts direct and selective tumor cell membrane-lytic effect. However, the sensitivity of different breast cancer cell lines to temporin-1CEa was different. We hypothesized that this difference might be due to various membrane structure components of different cell lines. In order to verify our hypothesis, in present study, the possible relationship between membrane components of different breast cancer cell lines and their sensitivity to temporin-1CEa-induced cytotoxicity will be studied using molecular, cellular and biophysical methods. The detailed molecular targets and dynamic processes of peptide-membrane interactions will be further demonstrated using liposome model membranes. The results of present study will provide experimental evidences for further structure-modification of anticancer peptides and the development of new class of anticancer drugs.

阳离子抗菌肽具有异于传统抗癌药物的生物膜损伤机制，对肿瘤细胞具有高选择性和低耐药性，基于生物膜结构特性来探索多肽-生物膜相互作用机制已经成为目前的研究热点。Temporin-1CEa (Tem)作为一种天然的阳离子抗菌肽，具有直接的选择性肿瘤细胞生物膜损伤作用，在体外表现出较强的乳腺癌杀伤活性，然而不同乳腺癌细胞对其敏感性有所差别。我们推测这种敏感性的差异很可能源于不同类型乳腺癌细胞多样的生物膜结构特性。因此，本项目拟进一步选取多种典型的人乳腺癌细胞，采用分子生物学、生物化学、生物物理学等实验技术手段，研究不同乳腺癌细胞生物膜脂质、蛋白质及阴离子等成分结构特性与Tem抑癌作用的相关性，并利用人工磷脂层模拟生物膜，考查Tem与肿瘤细胞生物膜相互作用的分子机制，从而进一步阐明Tem生物膜损伤作用的作用靶点和作用方式，为抗癌肽的结构改造及新型抗乳腺癌药物的开发提供实验依据。

阳离子抗癌肽一般多为疏水的、带正电荷的并且以一种两亲性的α-螺旋构象存在，这种结构可以促进肽与膜的相互作用能力，通过对癌细胞膜、细胞骨架、线粒体、细胞核等结构的入侵达到抗癌的作用效果。这种有异于传统抗癌药物的生物膜损伤机制，可以使此类肽选择性地作用于癌细胞，对正常细胞损伤较小，对人体几乎不具有毒性，且不易产生耐药性，因此有望发展成为新型的抗癌药物。然而基于不同癌细胞以及正常细胞生物膜结构特性来探索阳离子抗癌肽-生物膜相互作用的分子机制研究尚缺乏充分的理解。.本项目研究的两栖类活性肽temporin-1CEa是从中国林蛙皮肤分泌物中提取获得的一种α-螺旋阳离子抗癌肽，由17个氨基酸组成，含有9个疏水性氨基酸和7个亲水性氨基酸，具有较好的两亲性。本研究在前期工作基础上，研究比较了temporin-1CEa对5种人乳腺癌细胞的抑癌作用敏感性及其分子作用机制；并设计了6种temporin-1CEa的类似物，探索了temporin-1CEa及其改造肽发挥抑癌作用时与乳腺癌细胞生物膜成分之间的相关性，其中重点探讨了细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）与肽作用的相互关系。研究结果显示，temporin-1CEa以其阳离子净电荷和两亲性α-螺旋结构与癌细胞膜发生静电吸引和结合，破坏细胞膜的结构；同时，随着细胞膜的去极化和膜通透性的增大，temporin-1CEa还会进入细胞内，进一步引起线粒体膜电位的下降，并升高细胞内游离钙离子浓度和活性氧（ROS）的水平；接下来，temporin-1CEa还能继续通过核膜进入细胞核内，具备与DNA结合的能力，影响复制和转录，最终导致细胞的死亡。而temporin-1CEa对不同乳腺癌以及正常细胞作用的差异主要与细胞上以负电荷物质为主的膜成分相关。不同乳腺癌细胞以及正常细胞的细胞膜表面PS，硫酸乙酰肝素HS以及硫酸软骨素CS的表达程度不同。其中，PS可以结合肽，诱导其α-螺旋含量升高，有利于发挥破膜作用和抗癌活性；CS不影响肽的抗癌活性，HS则会抑制肽的抗癌活性，细胞膜表面的糖胺聚糖所携带的负电荷硫酸基团也能够明显抑制temporin-1CEa的作用活性；此外，不带电荷的胆固醇能够增强细胞膜的稳定性，影响肽的细胞毒作用。以上研究为深入探讨阳离子抗癌肽与膜相互作用的分子规律提供实验依据，对将来更有针对性地开发和设计高效低毒的新型抗乳腺癌药物分子具有重要意义。