纳豆菌脂肽诱导乳腺癌细胞凋亡的作用机制及其构效关系研究

脂肽是纳豆菌的重要功能成分，具有多种生物活性，但其活性机理和构效关系尚不明确。本课题在前期证明纳豆菌脂肽具有显著的人乳腺癌细胞（MCF-7）凋亡诱导活性的基础上，拟利用核磁共振、质谱及红外等仪器分析和化学研究方法确定纳豆菌脂肽的一级结构和构象对诱导MCF-7细胞凋亡活性的影响，并通过研究纳豆菌脂肽对MCF-7细胞的钙离子浓度、活性氧（ROS）的释放、Caspase家族、细胞膜流动性和PT孔的影响，揭示纳豆菌脂肽诱导乳腺癌凋亡的作用机制及其构效关系。研究结果可为脂肽生物活性作用机制及构效关系研究提供新的研究思路和借鉴方法，并可为纳豆菌的深度开发利用提供理论基础和技术依据。

本项目以纳豆菌作为研究对象，围绕其抗肿瘤活性物质的分离纯化及其作用机制进行研究。首先从纳豆菌代谢产物中，经过酸沉醇提、凝胶层析等手段分离纯化出具有明显抗肿瘤活性的单一组分脂肽（BnCLP），其分子量为1072Da。红外光谱分析表明该物质为环状脂肽，氨基酸自动分析仪和HPLC-MS/MS分析显示该脂肽的氨基酸序列为Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Glu-Leu。. 以体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞株为研究对象，探讨纳豆菌脂肽对肿瘤细胞增殖和凋亡的作用，并深入探讨相关的作用机理。体外增长抑制实验表明，纳豆脂肽能显著抑制MCF-7乳腺癌细胞的增殖，这种抑制作用呈现出浓度和时间依赖关系，作用24 h的IC50是40.2 µg/mL，作用48 h的IC50是32.3 µg/mL。HE染色法和AO/EB、Hoechst 33342/PI荧光双染发现，纳豆脂肽诱导MCF-7细胞发生典型的凋亡形态学改变。. 实验采用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察发现，经纳豆脂肽作用后，MCF-7细胞内的活性氧（ROS）水平和胞内游离钙离子（Ca2+）水平显著升高，这一趋势分别可被ROS抑制剂NAC和胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM所抑制，且Ca2+水平的升高是由ROS的大量生成所致。同时发现，ROS的升高将会导致PT孔的开放，PT孔专一性抑制剂CsA可以抑制其开放，PT孔的开放直接引起线粒体跨膜电位（ΔΨm）的显著降低，这一趋势可被NAC、BAPTA-AM和CsA所抑制。通过Western blotting实验发现，PT孔开放后，线粒体内细胞色素C（Cyt C）减少，而胞浆内的Cyt C则逐渐增多，胞内caspase-9蛋白的表达量也随之增加。此外，p-ERK蛋白表达量降低，Bcl-2蛋白表达量也随之下调。综上所述，纳豆脂肽具有诱导MCF-7肿瘤细胞发生凋亡的作用，其凋亡机制可能与线粒体途径及PT孔的开放有关。另外，ERK/MAPK通路参与了纳豆脂肽对MCF-7细胞的增殖抑制作用。该项目研究为纳豆菌代谢产物的应用奠定了坚实的理论基础。